HPV/p16 pozitivních a negativních HNSCC ukazují rozdíly v uzlových zapojení
Jsme zjistili HPV a p16 status 241 orofaryngeální karcinom dlaždicových buněk (OPC) pacientů léčených přípravkem (chemo)záření (c)RT. Vzorky lidského nádoru byly získány podle protokolů schválených etickou radou fakultních nemocnic Leuven (Leuven, Belgie) a byl získán předpokládaný souhlas všech pacientů. Klinickopatologické údaje byly získány z grafů pacientů a průměrná doba sledování byla 4, 19 roku. HPV pozitivních pacientů byly charakterizovány nižší T fázích s 45% (26 out of 58; p = 0.025) HPV pozitivních pacientů ukazuje, T1/2. etapa nádorů vzhledem k tomu, že to bylo 29% (51 z 175; p = 0.025), v HPV negativní skupiny. Navíc HPV pozitivní nádory vykazovaly významně vyšší (p = 0.014) uzlové postižení se 72% (42 z 58) HPV pozitivních pacientů vykazujících nádory N2 / N3, zatímco to bylo pouze 54% (95 ze 175) v HPV negativní skupině. Ačkoli vztah mezi stavem p16 a n fází nebyl významný, byl pozorován trend k vyššímu uzlovému postižení a pozitivitě p16. Šedesát tři% pozitivních pacientů s p16 vykazovalo nádory N2 / N3, zatímco u p16 negativní skupiny to bylo pouze 54% (Tabulka 1). Tyto výsledky jsou v souladu s jinými studiemi, což ukazuje, že pacienti s HPV pozitivním HNSCC mají vyšší n a nižší t stadia .
Jak se očekávalo, nízká T fázích za následek lepší vzdálenou kontrolu (DC) sazby s 5-ti letou kontrolu sazby z 83% a 70% (p = 0.04) pro T1/T2 a T3/4 nádorů, respektive (Další soubor 1: Obrázek S1A). Nádory N2/3 (5leté DC 70%; p = 0,02) vykazovaly vyšší riziko vzdáleného selhání ve srovnání s nádory N0/1 (5letá DC rychlost 85%; p = 0,02) (další soubor 1: obrázek S1B). Žádný statisticky významný rozdíl byl vidět v DC rychlost mezi HPV pozitivní a negativní onemocnění (5-rok DC sazba 82% vs 5-rok DC výši 72%, respektive; p = 0,20) (Další soubor 1: Obrázek S1C). I když to není významné, tento 10% rozdíl v rychlostech DC naznačuje vliv viru mimo lokální kontrolu nádoru. Navíc indikuje přítomnost různých vzorců šíření mezi HPV pozitivním a negativním HNSCC.
p16 potlačuje invazi a migraci kapacita HPV pozitivních HNSCC
zkoumat molekulární mechanismus za tyto potenciální rozdíly vidět v metastázy v naší kohorty pacientů, jsme hodnotili in vitro migraci a invazi kapacita HNSCC buněk. HPV / p16 pozitivní buňky SCC154 a SCC104 vykazovaly významně nižší míru migrace ve srovnání s HPV / p16 negativními buňkami SQD9, CAL27 a SC263 (obr. 1a). V souladu s migračním testem vykazovaly pozitivní buňky HPV/p16 snížené invazní schopnosti ve srovnání s negativními buňkami HPV/p16 (obr. 1b).
p16 represses the in vitro invasion and migration capacity of HPV positive HNSCC. a Migration capacity of HPV negative cells (SQD9, CAL27 and SC263) and HPV positive cells (SCC154, SCC104). b Invasion capacity of HPV negative SQD9 cells and HPV positive SCC154 cells. c Migration capacity of HPV positive SCC154 cells treated with shRNA for p16 (shp16) and control (shluc). D invazivní kapacita HPV pozitivních buněk SCC154 ošetřených shRNA pro p16 (shp16) a kontrolu (shluc). (a-d) výsledek je uveden jako průměr ± SEM ze tří pokusů a p-hodnoty jsou vypočteny pomocí oboustranného t-testu,
tumor supresorového p16 je dobře známo, regulátor buněčného cyklu a dobré náhradní marker pro HPV pozitivních HNSCC . Nedávné údaje navíc připisují širší roli p16, včetně role v migraci a potlačení angiogeneze . Proto jsme také zkoumali vliv p16 na migraci a invazi kapacita HPV pozitivní SCC154 buňky, manipulovat s short hairpin RNA (shRNA), p16 (shp16) a kontrolní shRNA (shluc). Downregulace exprese p16 zvýšila migrační a invazní kapacity buněk SCC154 (obr. 1c a d). Tato data ověřují přítomnost rozdílů ve vzorcích šíření mezi HPV pozitivním a negativním HNSCC a naznačují aktivní roli p16 v metastatické kaskádě.
p16 potlačuje migraci a invazi přes angiogeneze u HPV pozitivních HNSCC
je dobře známo, že angiogeneze, který je aktivně udržována v rakovinné buňky tím, že pro-angiogenní faktory, jako např. vaskulární endoteliální růstový faktor A (VEGFA), je vodítkem pro rakovinné buňky šíření a metastáz a podporuje agresivní progrese nádoru . Navíc negativní korelace mezi HPV / p16 a VEGFA je dříve popsána v HNSCC . Proto jsme hodnotili vztah mezi HPV, p16 a VEGFA v naší kohortě pacientů. HPV pozitivní pacienti vykazovali významně nižší exprese VEGFA s 54% (28 out of 51) pacientů ukazuje žádné nebo nízké exprese VEGFA oproti 32% (53 z 161) v HPV negativní skupiny (Tabulka 2). Ačkoli negativní korelace mezi VEGFA a p16 byla méně výrazná, byl pozorován trend významnosti(Tabulka 2).
Jsme dále zkoumali vztah mezi angiogenezí a p16 s in vivo xenografts injekčně s SCC154 HPV pozitivní buňky, manipulovat s shp16 nebo shluc. Vyšší počet krevních cév byl detekován u myších nádorů s nízkou expresí p16 ve srovnání s kontrolními nádory (obr. 2a). Kromě toho zvýšení vaskularizace vedlo k nižší nekróze, vyššímu počtu mitotických buněk a růstové výhodě nádorů exprimujících shp16 (další soubor 2: Obrázek S2A-C). Nemohli jsme ověřit zapojení p16 do suprese metastáz in vivo kvůli absenci metastazujícího zvířecího modelu. Růstová výhoda a zvýšená vaskularizace pozorovaná u nádorů myší shp16 však mohou vysvětlit častý výskyt pokročilých stadií T u pacientů s HPV negativními HNSCC.
Duální úlohy p16 v šíření HNSCC. tvorba krevních cév v modelech myši SCC154 shp16 a SCC154 shluc xenograft hodnoceno barvením CD31 (nad grafem); n = 5. b Průměrný počet mízní céva formace v SCC154 shp16 a SCC154 shluc xenograft myší modely hodnotí LYVE-1 barvení (nad grafem); n = 5. C průměrné skóre barvení alfa4 beta1 integrinu v SCC154 shp16 a SCC154 shluc myší xenograft modely; n = 5. d Average score of alpha4 beta1 integrin staining in HPV positive SCC154 (n = 7) and HPV negative SQD9 (n = 10) mouse xenograft models. a-d P-hodnoty jsou vypočteny pomocí oboustranného t-testu,
p16 stimuluje lymphangiogenesis a uzlové šíření v HPV pozitivních HNSCC
Tyto výsledky ještě nemusí vysvětlit výskyt podobných vzdálené recidivy sazby v HPV/p16 pozitivních a negativních HNSCC pacientů a rozhodně nevysvětlují vysoce významnou souvislost mezi HPV pozitivity a uzlové zapojení je popsáno v naší a několika dalších studiích . To je zvláště důležité, protože implikuje přítomnost vysokého lokálního metastatického potenciálu v HPV pozitivním HNSCC. Je zajímavé, že lymfangiogeneze, stejně jako angiogeneze, podporuje metastázy nádoru indukcí růstu nových lymfatických cév v nádoru a zvýšením přenosu buněk do lymfatických uzlin. Navíc zvýšená hustota lymfatických cév v nádorech je spojena se zvýšenými metastázami do lymfatických uzlin. . Proto jsme hodnotili tvorbu lymfatických cév homologním imunostainingem hyaluronanu lymfatické cévy (LYVE-1) u nádorů myší shluc a shp16. Zjistili jsme, že suprese p16 vedla k nižší hustotě lymfatických cév v HPV / p16 pozitivních xenograftech, což naznačuje dvojí roli p16 v metastázách (obr. 2b).
abychom pochopili funkci p16, zaměřili jsme se na integriny, protože tyto proteiny jsou přijímány jako klíčové regulátory angiogeneze a lymfangiogeneze . Navíc je již dříve dokumentována vazba p16 na integriny a ztráta buněčného šíření . Integriny, jako je alfa4 beta1, jsou důležitými modulátory lymfangiogeneze . Proto jsme hodnotili přítomnost alfa4 beta1 integrinu v myších nádorech SCC154 shluc a SCC154 shp16. Although not statistically significant (p = 0.09), shluc tumors showed a higher percentage of integrin compared to shp16 tumors (Fig. 2c). In line with SCC154 shRNA xenografts, tumors from HPV/p16 positive SCC154 xenografts showed higher percentage of alpha4 beta 1 integrin compared to tumors from HPV/p16 negative SQD9 xenografts (Fig. 2d).