stejně jako u izolace DNA se vědci běžně spoléhají na izolační sady RNA, aby jim usnadnili život. Nedávno jsme publikoval blog na DNA, čištění bez nářadí, který nastínil několik důvodů, proč dělat něco, aniž kit má své výhody: méně plastového odpadu, nižší náklady a méně, že odešel s partou náhodných řešení, když všechny spin sloupce dojdou. V tomto článku se zabýváme základy izolace RNA bez soupravy.

Tipy pro práci s RNA (zda používáte kit, nebo ne)

i když je samozřejmé, že jeden by měl vzít pozor, pokud děláte jakýkoli druh DNA nebo RNA čištění, aby se zabránilo kontaminaci, dbejte zvýšené opatrnosti při provádění RNA extrakce. RNA není ze své podstaty tak stabilní jako DNA-je jednovláknová a její ribózové skupiny jsou náchylné k hydrolýze a degradaci tepla. Kromě toho jsou Rnázy nebo enzymy, které degradují RNA, obzvláště vytrvalé proteiny, které se nacházejí ve všem a na všem, včetně vaší pokožky. Zde je několik obecných tipů pro práci s RNA, i když používáte soupravu:

• vždy noste rukavice, protože Rnázy na vašich rukou mohou degradovat RNA.
• udržujte čistý pracovní prostor, který může zahrnovat postřik vaší lavice produktem, abyste se zbavili RNáz, jako je RNaseZAP.
• při sklizni tkání, buněk, rostlin, hub nebo bakterií udržujte vzorky chladné a rychle pracujte na zmírnění degradace RNA.
• ujistěte se, že používáte vodu bez DEPC nebo Rnázy. Pokud používáte vodu ošetřenou DEPC, autoklávujte vodu k inaktivaci DEPC.
• ujistěte se, že použité nádobí nebo sklo neobsahuje Rnázy. RNase-free plasticware je snadno dostupný z vědeckého dodavatelů a sklo by mělo být zacházeno s DEPC roztoku po dobu 1 hodiny, a autoklávovat, aby se odstranily zbytkové DEPC. Alternativně může být sklo pečeno při 180°C po dobu nejméně 4 hodin.
• pokud jsou vaše konečné vzorky RNA resuspendovány ve vodě nebo TE pufru, skladujte je v mrazničce při teplotě -80°C, aby se zabránilo degradaci RNA. Degradují se v mrazáku -20°C.

RNA extrakce metody vyvinul jednoduchý protokol používá dodnes

Existuje mnoho alternativních metod pro izolaci DNA bez kit. To však není případ extrakce a čištění RNA. Existuje jedna jednoduchá metoda, která funguje, a variace této metody. Hlavní překážkou pro vývoj protokolů k izolaci RNA bylo to, že Rnázy se běžně vyskytují v buňkách, a bez něčeho, co blokuje aktivitu Rnázy při lýze buněk, RNA je degradována. Účinně izolovat neporušené RNA, rychlý, silný, protein denaturační přísada by bylo nutné – něco, co se rozbilo RNases před RNases měl šanci štěpí RNA na lýze buněk.

v pozdních 1970, Chirgwin a jeho kolegové ukázali, že silný proteinový denaturant, guanidinium thiokyanát, udělal právě toto (Chirgwin et al., 1979). Oni vyvinuli protokol určen pro izolaci RNA z krysí slezinu, v nichž jsou homogenizované sleziny v guanidinium thiokyanát řešení a točil po homogenátu odstranit nerozpustný materiál. Pak, homogenát byl nanesen na cesium chloridu přechody a ultracentrifuged pro až 20 hodin oddělit neporušené RNA z DNA a bílkovin. I když velmi účinné v izolaci celkové RNA, tato metoda vyžaduje hodně času a v závislosti na tom, kolik vzorků může mít přístup k jednomu nebo více velkých, drahých ultracentrifuge.

Obrázek 1: nástin různých kroků extrakce RNA.

vědci z NIH v polovině 1980 se rozhodli vyvinout protokol, který úplně vynechal ultracentrifugaci. Chomczynski a Sacchi ukázali, že RNA může být účinně oddělena od DNA a proteinů jednoduchým extrakčním protokolem s guanidinium thiokyanát-fenol-chloroform. Při této metodě jsou vzorky stále homogenizovány a lyzovány v roztoku guanidinium thiokyanátu. Namísto separace RNA pomocí gradientů cesia-chloridu se však do homogenátu přidá fenol nasycený vodou, octan sodný a chloroform a protřepe se. Po rychlé centrifugaci (ne ultracentrifugaci!), vrstvy fenolu a chloroformu samostatné a RNA je zachován v horní vodné vrstvy, zatímco DNA a další proteiny jsou zachovány v interfázi a spodní, organická vrstva. Vrchní vodná vrstva se extrahuje a RNA se pak může vysrážet isopropanolem. Tato metoda zkrátila čas potřebný k izolaci RNA z 20 + hodin na přibližně 4 hodiny a variace na této metodě bez sady jsou dodnes široce používány (Chomcynski a Sacchi, 2006).

podívejte se na náš protokol pro extrakci RNA!

díky tomu je jednoduchý protokol ještě spolehlivější (stále bez sady!)

jak bylo uvedeno výše, práce s RNA vyžaduje udržování vzorků v chladu až do homogenizace a lýzy buněk. To může být náročné, v závislosti na vaší laboratoře situace nebo tkáně, metoda sběru, tak biotechnologické společnosti na trh několik produktů, které pomáhají dále zjednodušit tento proces a/nebo stabilizace RNA během tkáně shromažďování a homogenizaci. Nejznámějším z těchto produktů je TRIzol® (nazývaný také TRI Reagent®, RNAzol®, QIAzol® a prodávaný mnoha různými společnostmi). TRIzol® je roztok kyseliny-guanidinium-fenolu all-In-one, který kombinuje homogenizační roztok a přidání fenolu původního protokolu no-kit do jednoho kroku. Po homogenizaci v Trizolu® se nerozpustný materiál odstraní centrifugací a supernatant se extrahuje chloroformem jako ve výše uvedené metodě no-kit.

vědci také vyvinuli způsoby, jak „stabilizovat“ RNA v tkáních před lýzou buněk. Tyto produkty, a to RNAlater® od Thermo a RNAProtect® od Qiagen, jsou síran amonný-based řešení, které pracují tím, že inhibuje RNase činnosti v rámci buňky nebo tkáně – nemají vlastně chemicky stabilizovat molekuly RNA (Allewell a Sarma, 1974). Kromě toho ThermoFisher poskytuje protokol o tom, jak integrovat RNAlater® s použitím TRIzol® a stabilizační roztoky síranu amonného mohou být vyrobeny v domě.

společný problém s ne-kit RNA extrakce metody je přenos DNA, které mohou potenciálně komplikovat výsledky navazující aplikace, jako je kvantitativní PCR posoudit genové exprese. Existuje několik věcí, které mohou vědci udělat pro boj s tímto problémem. V první řadě, být si vědom svého extrakce – pokud potřebujete opravdu čisté RNA, je důležité se ujistit, že při rozbalování, pouze vodné vrstvy, aby se zabránilo přenosu DNA z dolní části, organická vrstva. Dalším trikem je vysrážet RNA pomocí chloridu lithného. Roztoky LiCl selektivně vysráží RNA, ale ne DNA a proteiny. A konečně, pomocí Dnázy (existuje několik Dnáza je enzym produktů na trhu z čeho vybírat) na resuspendované RNA vzorku pomůže zajistit DNA kontaminace není problém.

Chirgwin JM, Przybyla AE MacDonald RJ, Rutter WJ (1979) Izolace biologicky aktivních ribonukleová kyselina ze zdrojů obohacený ribonuclease. Biochemie 18: 5294-5299. https://doi.org/10.1021/bi00591a005

Chomczynski P, Sacchi N (2006) The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate–phenol–chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols 1:581–585. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.83