Pět Pax-6 variant a jejich exprese vzory v squid embryí a dospělých očních tkání

provedli Jsme jeden 3′-RACE PCR pro trpasličí chobotnice Pax-6 gen (označen jako IpPax-6) vyšetřovat sestřih variant a více lokusů Pax-6 v coleoid hlavonožci. Zjistili jsme, že v pygmejské chobotnici nebylo více lokusů, ale identifikovali jsme tři varianty diskrétních délek Pax-6. Rozdíly v aminokyselinových sekvencích mezi těmito variantami Pax-6 byly omezeny na omezené oblasti. Proto se předpokládalo, že jsou výsledkem alternativních sestřihových událostí jediného lokusu. Dále jsme ověřena přítomnost sestřih variant pomocí RT-PCR a jsme konečně obdrželi pět typů spojování variant, včetně zjevného ortholog autentické Pax-6 (Obrázek 1). Délka a struktura autentických IpPax-6 byly podobné jako u genů Pax-6 nalezených u jiných druhů chobotnic, Euprymna scolopes a Loligo pealei15, 16. Autentické IpPax-6 (autentické podobě, 499 aa) se skládá ze dvou nezávislých DNA-binding domain, PD a HD domény a C-terminální P/S/T-bohaté domény (PST), který je vyhrazený aktivátor s partnerem trans-activator protein, jak je uvedeno v mnoha zvířat (Obrázek 1). Jak podobnost proteinové sekvence, tak fylogenetický strom potvrdily, že IpPax-6 je ortholog mouchy ey a obratlovců Pax-4/6 (Doplňkový obrázek 1). Čtyři identifikované varianty produkovaly proteiny s délkami odlišnými od délky autentického IpPax-6 (Obrázek 1).

prozkoumat fáze-konkrétní vyjádření chobotnice Pax-6 variant byla provedena Q-PCR za různých tkáních a v různých embryonálních fázích pomocí primerů navrženy tak, aby zaměřit se na další exons z IpPax-6 (Obrázek 2 & Obrázek S2). Vejce chobotnice vykazují epibolickou gastrulaci a přímý vývoj bez typických stádií larvy měkkýšů17. Embryonální oči vypadají z vnější epiderm z blastodisc a jsou diferencovatelné po stádium 18 s retinální pigmentace začíná na fázi 20. Čočka se jeví jako průhledná tyčovitá struktura viditelná pouhým okem ve fázi 25. Nejprve jsme provedli Q-PCR s využitím primerů zaměřených na exon 2, který pokrývá všech pět variant. Analýza Q-PCR ukázala, že IpPax-6 byl exprimován ve stadiu 16 před tvorbou očních váčků (obrázek 2A). Vyjádření intenzity IpPax-6 byl postupně upregulated s rozvojem chobotnice embrya (Obrázek 2A), s okem ukazuje nejvyšší vyjádření podpory mezi tkání testovány. Jak bylo pozorováno v jiných bilaterian zvířata, autentický a variantní formy IpPax-6 byly vyjádřeny na výrazně snížené úrovni ve svalové tkáni. Poté jsme použili primery zaměřené na varianty postrádající exon 4 (varianty 1 a 3, obrázek 2B). Primery detekovaly varianty 1 a 3 na nízkých hladinách v embryích ve stadiu 16 a ve tkáni oční bulvy. Použili jsme také primery zaměřené na varianty včetně exon 6 (varianty 2 a 3, obrázek 2C). Analýza Q-PCR ukázala, že varianty 2 a 3 byly exprimovány v očních bulvách a optických lalocích i v embryích ve stádiích 16 a 25. Vzhledem k tomu, že tvorba fotoreceptorových buněk a čočky začíná v embryích ve stadiu 25, mohou varianty včetně exonu 6 přispívat k vývoji očí. Výsledky ukazují, že vzorce exprese variant IpPax-6 se výrazně lišily od vzorů autentického IpPax-6.

rozlišovat varianty, které jsou přítomny v každé fázi, jsme provedli RT-PCR s využitím primeru sady přes exon hranice. Varianta 1 byla považována za exprimovanou ve všech / některých embryonálních stádiích, ale ne v očích dospělých (Doplňkový obrázek 2). RT-PCR analýza také ukázala, že varianta 4 byla silně exprimována v dospělých očích, zejména v sítnici, ale ne v čočkách (Doplňkový obrázek 2A). Varianty 2 a 3 byly exprimovány ve všech embryonálních stádiích a také v dospělých tkáních (Doplňkový obrázek 2B).

identifikovat tkáňově specifické exprese IpPax-6 variant, jsme provedli in situ hybridizace pomocí RNA sondy určen k specificky vázat k sobě varianta (Obrázek 2D–G). Sonda RNA navržená z exonu 2 se zaměřuje na všech pět variant identifikovaných v této studii. Sonda RNA navržená z exonu 4 vázaná na autentickou formu a na varianty 2 a 4. IpPax-6 bylo zjištěno, že být lokalizována v mozku oblasti, včetně hřbetní bazální lalok, vynikající čelní laloky, stopka/čichové laloky a optických laloků (Obrázek 2D–G), jak je popsáno v Hartmann et al.18 tkáň mimo sítnici (možná odpovídající budoucí vrstvě iridoforu) také jasně vyjádřila IpPax-6 ve stadiu 22 (Obrázky 2D a 2D‘). Exprese IpPax-6 byla v této vrstvě pozorována až do stupně 25. In situ hybridizace s využitím sondy cílení exon 4 navrhl, že varianty 2 a 4 měl podobný výraz vzorců v mozku, ale ne v očích (Obrázek 2E). Toto zjištění naznačuje, že varianty 1 a 3 (postrádající exon 4) jsou upregulovány ve vnější vrstvě očí. Tyto důsledky naznačují, že každá varianta IpPax-6 je regulována nezávisle na procesech tvorby očí.

Exon-intron struktury Pax-6 v jiných hlavonožců/měkkýšů

zkoumali Jsme, zda tento typ alternativní sestřih byl pořízen pouze v coleoid hlavonožci. Použití RT-PCR analýzu Japonské kopí olihně (Loligo bleekeri) embryonální RNAs, našli jsme tři typy mRNAs možná odvozen od alternativního sestřihu (exon 4 skákání, exon 3 vložení a exon 6 vložení) do očí (Obrázek 3A, B). Vložené exons 3 a 6 zadán 20 a 40 aminokyselin, respektive, vzhledem k tomu, že přeskočil exon 4 zakódované 51 aminokyselin. Zkoumat přítomnost podobného alternativního sestřihu v jiných genomech měkkýšů, zkoumali jsme exon-intronové struktury Pax-6 v sova limpet a pearl oyster. Kompletní sekvence genomu, sovy klíště (Lottia gigantea, získané z institut jane goodallové genom, portál Lotgi v1.0, e_gw1.86.103.1)19 a pearl oyster (Pinctada fucata, získané z OIST Mořské Genomika Jednotka prohlížeče genomů P. fucata_ver1.0, přepis: pfu_aug1.0_8418.1_67856.t1, lešení 8418.1) 20 ukázalo, že molluscan Pax-6 má pět exonů. Exon 4 v chobotnici byl zachován napříč testovanými druhy měkkýšů. Exony 3 a 5 však nebyly nalezeny v genu PAX-6 pearl oyster. Zjistili jsme tedy, že variantní formy 2 a 4 byly získány v linii coleoidních hlavonožců (Obrázek 1).

Na našich nejlepších znalostí, naše studie je první zpráva v-rám sestřih variant chobotnice Pax-6, které byly vyjádřeny různě v závislosti na embryonálním stadiu. Předchozí studie izolované diskrétní typy spojování variant, které ztratil v N-terminální polovina PD domény v jiných chobotnice species15,18, ale tyto varianty nevykazovaly časoprostorové rozdíly v projevu. Naše studie také navrhl, že základní mechanismy získávání změn v Pax-6 přepisy alternativní sestřih byly jednoznačně získala v coleoid hlavonožců rodu, jako nižší měkkýšů, například mlži, nemají odpovídající exon-jako fragment v jejich genomy.

Funkce chobotnice Pax-6 variant a jejich předpokládané roli v oku rozvoj

přidávání a mazání aminokyseliny fragment zakódované v alternativně použít exons se očekává, že způsobí strukturální změny v IpPax-6 proteinových variant, které mohou změnit jejich funkce v procesu vývoje. Dvě z jeho variant (varianty 1 a 3) postrádají 153mer uprostřed autentického Pax-6 a polovinu HD (Obrázek 1). Abychom zjistili, zda delece ovlivňuje jejich funkční vlastnosti, provedli jsme trojrozměrné (3D) strukturální předpovědi proteinů založené na srovnávacím modelování. Byly konstruovány domnělé 3D struktury HDs autentického IpPax-6 A varianta postrádající segment kódovaný exonem 3. Struktura šablony byla identifikována formou vázanou na DNA, abychom mohli předpovědět strukturu IpPax-6 a variantu ve formě vázané na DNA. Domnělá 3D struktura autentické formy byla přiměřeně dobře modelována; jádro zbytky, a to, Phe na smyčce před prvním helix HD, Leu na první helix, Leu na druhé šroubovice a Trp a Phe na třetí helix modelu struktury byly zachovány a tři šroubovice HD byly zřejmě pevně zabalené do jedné další (Obrázek 3C). Zbytky důležité pro DNA závazné, a to, dva Arg zbytků v N-koncové rameno a polární zbytky na povrchu třetí šroubovice, byly umístěny poměrně blízko DNA rozhraní (Obr. 3C, D). Domnělá 3D struktura varianty však představovala řadu problematických otázek. V modelované struktury, ztráta regionu kódovány pomocí exon 3, který kóduje N-terminální část první helix, byl kompenzován 15 zbytky zakódován v exonu 2. Aminokyselinové sekvence autentických a variantních forem se tedy lišily pouze v oblasti obsahující 15 zbytků n-koncové strany. Tento rozdíl však významně zvýšil strukturální energii varianty a zjevně destabilizoval celkovou strukturu. Tato nestabilita může být důsledkem nedostatku Phe na smyčce před první šroubovice a Leu na první šroubovice. Tyto komponenty jsou zjevně důležité pro balení tří šroubovic. Kromě toho ve variantě chyběly dva zbytky Arg na n-koncové smyčce, které se vážou na DNA báze v menší drážce v autentické podobě. Tyto problémy se stabilitou a vazbou DNA ve variantě silně naznačují, že HD varianty je nestabilní a že doména má malou vazebnou afinitu k DNA (obrázky 3D a 3D‘). Nedostatek stabilního HCH dále naznačuje, že varianty 1 a 3 mají různá cílová místa DNA než autentická IpPax-6 u druhů chobotnic.

dvě varianty (varianty 2 a 3) také vykazovaly vložení 120 mer v doméně PST (Obrázek 1). Bylo zjištěno, že vložená sekvence je specifická pro chobotnici (Obrázek 2). Toto vložení může změnit transaktivační aktivity PST domény. Varianta 4 ukázala unikátní vložení (57 mer) mezi PD a HD. Program Motif (http://www.genome.jp/tools/motif/) nenašel ve Vložené sekvenci žádné známé domény ani podpisy. Toto vložení prodlužuje linker mezi doménami PD a HD.