Jaký je rozdíl mezi Southern, Northern a Western Blot?

k identifikaci jedinečných proteinů a sekvencí nukleových kyselin se používají různé techniky blotování. Southern, northern a western blot protokoly jsou podobné, a začít s elektroforetická separace proteinů a nukleových kyselin fragmentů na gelu, které jsou pak přeneseny na membránu (nitrocelulózové membrány, polyvinylidene difluoride (PVDF) membránu, atd.), kde jsou imobilizovány. To umožňuje radioaktivně značené nebo enzymaticky značené protilátky nebo DNA sondy vázat imobilizovaný cíl a zajímavé molekuly pak mohou být vizualizovány různými metodami. Blotovací techniky jsou vybrány na základě cílové molekuly: DNA, RNA nebo protein. (Obrázek 1, Tabulka 1).

Southern Blot

Southern blot se používají k určení identity, velikosti a množství specifických sekvencí DNA. Protokol southern blot začíná extrakcí DNA z buněk nebo tkání,která se pak enzymaticky štěpí za vzniku fragmentů DNA. Fragmenty jsou odděleny podle velikosti na agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu elektroforézou. Menší fragmenty budou migrovat dále na gel než větší. Po elektroforéze se DNA na gelu přenese na nylonovou membránu. Membrána je inkubována sondou nukleových kyselin, která má sekvenci homologní s cílovou sekvencí a je označena radioaktivitou, fluorescenčním barvivem nebo enzymem schopným generovat chemiluminiscenční signál. Hybridizace komplementárních sekvencí nastává během inkubace a unhybridizovaná sonda se odstraní promytím pufrem. Plně hybridizované značené molekuly sondy zůstanou vázány na skvrnu. Detekční metody se liší podle označení sondy; radioaktivně značené sondy jsou vizualizovány rentgenovým filmem nebo fosforimagingem a enzymaticky značené sondy jsou vizualizovány chemiluminiscenčním substrátem.

Southern blot protokolu

1. izolace DNA
2. Omezení trávení: trávení DNA s omezením enzym, a pokud je to nutné, soustředit se rozštěpí DNA.
3. gelová elektroforéza: připravte agarózový gel a buď Tae nebo TBE pufr (výběr pufru bude záviset na délce běhu a velikosti fragmentů DNA). Vložte vzorky do jamek a zahrňte marker molekulové hmotnosti DNA. Spusťte gel.
4. přenos:
   • vložte gel do nádoby s denaturačním roztokem a dvakrát jej umyjte 15 minut na třepačce.
   • opláchněte vodou a poté promyjte neutralizačním roztokem.
   • během předchozího kroku začněte připravovat papír Whatman a nylonovou membránu pro přenos.
   • Sestavte přenosový přístroj s membránou, papírem Whatman a gelem a přeneste jej do SSC nebo SSPE pufru.
   • Po dokončení přenosu zkřížte DNA v síťovině a poté opláchněte membránu.
5. Pre-hybridizace (blokování):
   • blokování snižuje nespecifickou vazbu na membránu. Připravte předhybridizační roztok a přidejte vzorek DNA. Odstraňte skvrnu z křížového propojení, přidejte předhybridizační roztok a inkubujte.
6. hybridizace:
   • připravte směs sondy (komplementární řetězec DNA) a pufr.
   • odstraňte předhybridizační roztok a inkubujte skvrnu sondou (inkubační doby se budou lišit v závislosti na aplikaci).
   • Po inkubaci provádět low-přísnost umýt následuje high-přísnost umýt upřesnit DNA.
7. detekce sondy:
   • membránu opláchněte, přeneste do nádoby s blokovacím roztokem a inkubujte.
   • blokovací roztok zlikvidujte, nahraďte roztokem protilátek a inkubujte.
   • zlikvidujte roztok protilátek, promyjte membránu.
8. postupujte podle pokynů výrobce pro chemiluminiscenční detekci.

Severní skvrna

Severní bloty se používají k určení identity, velikosti a množství specifických sekvencí RNA. Protokoly Northern blot začínají izolací RNA a separační techniky se liší v závislosti na velikosti RNA. Velké RNAs jsou odděleny pomocí elektroforézy na formaldehyd agarózového gelu nebo glyoxalu agarózovém gelu, který zabraňuje normální base párování a udržuje RNA v denaturovaném stavu. Malé RNA jsou odděleny na denaturačním (močovinovém) polyakrylamidovém gelu. RNA se pak přenese z gelu na nylonovou membránu, která se pak inkubuje radioaktivně nebo neizotopicky značenou RNA, DNA nebo oligodeoxynukleotidovou sondou. Nehybridizovaná sonda se odstraní promytím pufrem. Radioaktivně značené sondy jsou vizualizovány rentgenovým filmem a enzymaticky značené sondy jsou vizualizovány chemiluminiscencí.

Northern blot protokolu

1. RNA izolace
2. Elektroforéza:
   • formaldehyd agarózovém gelu: připravte si gel a vložte gel do zásobníku přístroje. Naplňte mops pufrem, načtěte vzorky a zahrňte marker molekulové hmotnosti. Spusťte gel a poté jej před blotováním ořízněte.
   • pro gel glyoxal agarose: připravte gel a vložte gelovou misku do přístroje. Naplňte mopy pufrem, připravte vzorky a vložte do jamek spolu s žebříkem RNA.
   • pro denaturační polyakrylamidový gel: odlijte gel a namontujte jej do elektroforetické jednotky. Připravte vzorky, vložte do gelu a spusťte s TBE běžícím pufrem.
3. Doprava:
   • formaldehyd agarózového gelu nebo glyoxalu agarózového gelu: umyjte gel v SSC, pak sestavit převod jednotky s gel, filtrační papír a nylonové membrány. Po dokončení přenosu umístěte membránu do UV síťovinového propojení.
   • Na denaturačním polyakrylamidovém gelu: sestavit převodu jednotky včetně gel, filtrační papír a nylonové membrány, což zajišťuje, že jsou zaplaveny s TBE. Když je přenos dokončen, umístěte membránu do UV příčného propojení, aby se RNA fixovala na membránu.
4. Pre-hybridizace (blokování):
   • Pre-hybridizace membrány v hybridizačním roztoku.
5. hybridizace:
   • přidejte sondu do hybridizačního roztoku a inkubujte.
   • Mytí membrány v low-přísnost myje odstranit hybridizačního roztoku a nehybridizované sondy, a high-přísnost myje odstranit částečně hybridizované molekuly.
   • postupujte podle pokynů výrobce pro chemiluminiscenční detekci.

Western Blot

Western blot jsou určeny pro stanovení identity, velikosti a množství specifických proteinů ve vzorku. Protokol western blot začíná přípravou lyzátu vzorku z tkáňové nebo buněčné kultury a separací na polyakrylamidovém gelu elektroforézou. Oddělené proteiny se pak přenesou na membránu nitrocelulózy nebo polyvinyliden difluoridu (PVDF). Membrána je inkubována s blokační činidlo, aby se zabránilo nespecifické vazby, následuje inkubace s primární protilátky vázat na proteinové zájmu. Existují dvě detekční metody, přímé a nepřímé. Přímá detekce (Obrázek 2) spoléhá na značené primární protilátky, vzhledem k tomu, že nepřímé detekce vyžaduje primární protilátkou proti cílový protein, a sekundární protilátkou zamířenou proti immunoglobin třídy nebo podtřídy primární protilátka druhů (Obrázek 3). Vizualizační metody zahrnují kolorimetrické testy, ve kterých se vytváří barevná sraženina, chemiluminiscence a fluorescence.

Western blot protocol

1. připravte lyzát z buněčné kultury nebo tkáně.
2. Příprava vzorku:
   • stanovení koncentrace proteinu každého vzorku pomocí testu kvantifikace proteinů (tj. Bradford).
   • přidejte ke každému vzorku stejný objem 2x laemmli sample buffer.
   • některé vzorky může být nutné zredukovat nebo denaturovat, toho je dosaženo varem vzorků v pufru.
3. elektroforéza:
   • připravte gel SDS-PAGE, načtěte vzorky spolu s markerem molekulové hmotnosti.
   • spusťte gel v běžícím pufru.
4. přenos:
   • po elektroforéze sestavte přenosovou jednotku včetně gelu, PVDF nebo nitrocelulózové membrány a filtračního papíru.
   • přeneste proteiny na membránu pomocí přenosového pufru.
5. Barvení Protilátek (nepřímá detekce):
   • Připravit blokujícím pufru a inkubovat membránu pro snížení nespecifické vazby.
   • inkubujte membránu primární protilátkou zředěnou v blokujícím pufru.
   • promyjte membránu v TBST a inkubujte s konjugovanou sekundární protilátkou zředěnou v blokujícím pufru.
   • omyjte membránu v TBST.
   • postupujte podle pokynů výrobce pro chemiluminiscenční detekci.