hlavním účelem Negativní barvení je studium morfologických tvar, velikost a uspořádání bakterií buněk, které je obtížné skvrny. např.: Spirilla. To může být také použit k obarvení buňky, které jsou příliš jemné být tepelně pevné.
používá se také k přípravě biologických vzorků pro elektronovou mikroskopii. Používá se k prohlížení virů, bakterií, bakteriálních bičíků, biologických membránových struktur a proteinů nebo proteinových agregátů, které mají nízkou sílu rozptylu elektronů. To je také používáno pro studium a identifikaci vodné lipidové agregáty jako lamelární liposomy (le), inverzní sférické micely (M) a inverzní hexagonální HII válcové (H) fáze Negativní barvení transmisní elektronové mikroskopie.
princip negativního barvení
negativní barvení vyžaduje kyselé barvivo, jako je inkoust Indie nebo Nigrosin.
Indický inkoust nebo Nigrosin je kyselá skvrna. To znamená, že skvrna se snadno vzdává vodíkového iontu (protonu) a chromofor barviva se záporně nabije. Protože povrch většiny bakteriálních buněk je záporně nabitý, povrch buněk odpuzuje skvrnu. Sklo sklíčka se zbarví, ale bakteriální buňky ne. Bakterie se objeví jako jasné skvrny na tmavém pozadí.
Činidla Negativní Barvení
inkoustu
Nigrosin
Nigrosin 100 g/L, Formaldehydem 5 ml/L ve vodě
Postup Negativní Barvení
1. Umístěte velmi malou kapku (více než smyčku plnou, méně než volnou kapku z kapátka) nigrosinu blízko jednoho konce dobře vyčištěného a zapáleného sklíčka.
2. Odebrat malé množství kultury od slant s očkovat smyčky a rozptýlit je v drop skvrny bez šíření drop.
3. Použijte další čistý sklíčko k šíření kapky skvrny obsahující organismus pomocí následující techniky.
4. Položte jeden konec čistého sklíčka na střed sklíčka skvrnou. Nakloňte čistý snímek k poklesu svírající ostrý úhel a nakreslit snímek k poklesu, až se dotkne kapka a způsobuje, že se šíří podél okraje rozmetadlo snímek. Udržování malý ostrý úhel mezi snímky, zatlačte rozmetadlo posuňte směrem k čisté konci snímku, že obarví přetažením pokles za rozmetadlo slide a výrobu široké, i, tenký nátěr.
 |
 |
5. Nechte nátěr zaschnout bez zahřívání.
6. Zaostřete tenkou oblast pod ponořením oleje a pozorujte nezabarvené buňky obklopené šedou skvrnou.
Postup pro zobrazení v transmisním Elektronovým Mikroskopem (TEM)
- Držet coated grid flim straně se v páru, samostatně upínací kleště.
- vytvořte směs vzorku a negativní skvrny v poměru 1:1 (např. 2% uranylacetátu nebo 2% fosfotungstátu sodného nebo draselného, pH 7, 4). Přidejte 5µl do mřížky. Menší částice adsorbují na povrch mřížky rychleji než větší částice.
Alternativně může být vzorek smíchaný s fixačním činidlem přidán do mřížky před následným negativním zbarvením. - inkubujte po dobu 30-90 sekund a poté odstraňte přebytečnou tekutinu s roztrženým okrajem
kusu filtračního papíru. - usušte na vzduchu a zkontrolujte V TEM.
Výsledky Negativní Barvení
