Endotelu
endotel rohovky představuje nejvnitřnější vrstvu rohovky, které ji oddělují od vodné humor v přední komoře oka (Obr. 61.1). Endotel se skládá z jedné vrstvy (přibližně 4 µm) z dlaždicových buněk, které se vyznačují výraznou expresi iontových pump jako je Na+/K+/Atpázy a tight junction proteiny jako ZO-1 (Tabulka 61.1). Tato vrstva slouží jako bariéra pro udržení správného stavu dehydratace rohovky pomocí mechanismu úniku čerpadla .
Ztráta nebo dysfunkce rohovky endoteliální buňky (CECs) vytváří nadměrné nahromadění tekutiny v rohovce, což vede k progresivní otok, stromální dezorganizace, snižuje transparentnost, a zhoršené vidění . Hlavními příčinami endoteliální ztráty a dysfunkce rohovky jsou endoteliální dystrofie,trauma / chirurgie nebo chronická přední uveitida. Fuchsova endoteliální dystrofie rohovky a vrozená dědičná endoteliální dystrofie patří mezi nejčastější endoteliální dystrofie rohovky způsobené genetickými mutacemi a potenciálními faktory prostředí . Další častou příčinou endoteliální dystrofie, pseudofakická bulózní keratopatie, je indukována poškozením endotelu během operace katarakty. Diabetes a stárnutí jsou také významnými rizikovými faktory pro ztrátu endotelu rohovky.
na rozdíl od epiteliálních buněk, které se mohou opravit proliferací, mají dospělé céka omezenou proliferativní kapacitu. Místo toho mají endotelové buňky tendenci se opravovat posunutím směrem k oblasti poranění a zvětšením sousedních buněk. Ačkoli tento mechanismus udržuje endoteliální bariéru rohovky po poranění, snižuje také hustotu endotelových buněk a mění jejich hexagonální morfologii a čerpací kapacitu. Když snížení hustoty buněk dosáhne rozmezí 500-1000 buněk / mm2 nebo méně, jedinou dostupnou terapeutickou možností je částečná nebo úplná transplantace rohovky . V současné době představuje transplantace rohovky pro endoteliální ztrátu 60% všech transplantací rohovky provedených ve Spojených státech .
k překonání výše popsaného nedostatku dárců rohovkové tkáně se počáteční úsilí zaměřilo na izolaci a ex vivo expanzi primárních CEC. První úspěšná kultura lidských CEC byla hlášena v roce 1965 . Od té doby, několik změn v izolaci techniky, extracelulární matrix, substráty, kultura a média byly vyvinuty k překonání buňky omezené šíření kapacitu a ztrátu CEC fenotyp v kultuře . Například Okumura a spol. zkoumal expresi různých izoforem lamininu v rohovce a identifikovány lamininu-511 a 521 jako převažující lamininu formy u dospělých DM . Použitím těchto dvou lamininů jako substrátu pro in vitro kulturu lidských CEC, podařilo se jim výrazně zlepšit připojení, přežití, a rozšíření CEC . Jiné skupiny se pokusily kultivovat lidské CEC na DM odvozených od lidských dárců jako substráty. Výhodou tohoto přístupu je, že napodobuje prostředí rohovky in vivo, aby bylo dosaženo správné údržby a růstu CEC . Důležitost DM při podpoře expanze CEC byla také potvrzena nedávnou studií provedenou v modelu endoteliálního poškození rohovky králíka. Prostřednictvím toho bylo prokázáno, že absence DM narušila nativní migraci CEC a regeneraci rohovky .
navzdory výhodám použití lešení komplikuje podání do rohovky, což vyžaduje komplikované chirurgické postupy. Mnohem jednodušším přístupem by bylo dodávat CEC v buněčné suspenzi. Injekce buněk v suspenzi by umožnila jednodušší výrobní metody a teoreticky by byla méně invazivní . Tento přístup však zvyšuje riziko odstranění injikovaných buněk proudem komorové vody, což omezuje přežití buněk a štěpení v rohovce. Dvě metody vyvinuté ke zlepšení dodávání buněčných suspenzí do endotelu rohovky zahrnují použití dodávky řízené magnetickým polem a coinjekce buněk pomocí inhibitoru hornin. Pro dodávání magnetických buněk jsou CEC označeny magnetickými částicemi a dodávány na příslušné místo na povrchu zadní rohovky pomocí vnějšího magnetu . V nedávném příkladu byly CEC značeny superparamagnetickými nanočásticemi a injikovány do přední oční komory dospělých králíků s poškozením CEC. Podobně jako nativní CEC, injikované buňky vytvořily monovrstvu a obnovily průhlednost rohovky bez jakýchkoli nežádoucích účinků . Případně Okumura a kol. použitá coinjekce CEC s inhibitorem hornin Y27632 pro zvýšení přežití a proliferace CEC. Tento přístup měl za následek lepší štěpení buněk a lepší obnovení průhlednosti rohovky u králičího modelu poškození rohovky . Tyto blahodárné účinky byly potvrzeny na opičím modelu endoteliální dystrofie rohovky, což vedlo k zahájení klinických studií u lidí. V roce 2018 stejná skupina oznámila výsledky transplantace CECs, v kombinaci s ROCK inhibitorem, u 11 pacientů z bulózní keratopatie; více než 80% léčených pacientů ukázala, obnova tloušťky rohovky a zlepšení zrakové ostrosti 24 týdnů po léčbě . Tato studie poskytla první klinický důkaz, že minimálně invazivní transplantace kultivovaných lidských Céků může být použita jako nová terapeutická možnost k léčbě endoteliální dysfunkce rohovky. Současně vznesla otázky týkající se budoucího vývoje tohoto přístupu. Mezi ně patří třeba určit vhodný dárce věkové rozmezí pro výrobu vysoce kvalitní transplantabilní CECs, mechanistické příspěvek ROCK inhibitor klinické výsledky, přesné dávkování buněk k vyvážení účinnosti a bezpečnosti, a vývoj prostředků pro sledování osudu dodáno buněk po transplantaci . Kromě toho, omezená dostupnost vysoce kvalitních dárce CECs a omezené kapacitě buňky expandovat in vitro se zastavil některé významné výzvy pro klinické překlad tohoto přístupu.
z tohoto důvodu, několik skupin se snaží vytvářet CEC-jako buňky z alternativních kmenových buněk zdrojů, jako je například Msc, kůže-odvozené buňky, stromální buňky rohovky, a Jkm . Tyto studie aplikovaly naše současné chápání embryonálního vývoje CEC izolováním domnělých populací progenitorů CEC, jako jsou NCC,z primárních buněk a jejich diferenciací na zralejší buňky podobné CEC. Například, rohovkové stroma buňky a kůže-získané prekurzory obsahující Ncc byly izolovány a kultivovány v přítomnosti kyseliny retinové a GSK 3β inhibitor (Wnt signální dráhy aktivátor) k vyvolání CEC-jako buňky. Tyto buňky ukázaly, upregulace Pitx2, klíčový transkripční faktor pro rozvoj přední oční segment, stejně jako upregulace CEC značky Atp1a1 a Cdh2. Důležité je, že buňky vykazovaly funkční vlastnosti CEC, jako je funkce čerpadla. Když byly buňky transplantovány pomocí kolagenového listu jako nosiče, obnovily vidění v králičím modelu keratopatie . Použití podobného přístupu, Shen et al. diferencované prekurzory odvozené z kůže pomocí kokultury s b4g12, zvěčněnou lidskou linií CEC. Do 1 týdne od diferenciace vykazovaly buňky výraznou expresi typických CEC markerů. Transplantace těchto buněk vedla k úspěšnému obnovení tloušťky rohovky a průhlednosti rohovky u králičích i opičích modelů endoteliální dystrofie rohovky .
NCC mohou být také generovány in vitro z PSC, což nabízí neomezený a rozšiřitelný zdroj buněk pro klinickou aplikaci. Zhang et al. hlásil diferenciaci lidských Esc na periokulární mezenchymální prekurzorové buňky (POMPs), podtyp NCC, transwell kokulturou s lidskými rohovkovými stromálními buňkami. Tyto vyvolané POMPs byly kultivovány v podmíněné média z čočky epitelové buňky a diferenciaci byla potvrzena testy genové exprese typických CEC značky jako je N-Cadherin, FoxC1, a PITX2. Obohatit pro CEC-jako buňky, buňky byly poté seřazeny a nasazený na decellularized prasat rohovkové matrix následuje úspěšné transplantaci a indukce rohovky opravy do králičí model dystrofie rohovky .
Aby se zabránilo použití xenogenních materiálů z decellularized rohovky, posledních přístupy využívající malé molekuly, sloučeniny a xeno-free růstových faktorů k navození CEC mobilní osud. Několik skupin například prokázalo diferenciaci PSC na NCC po inhibici dráhy TGFß / SMAD . Tyto národní střediska pro padělky byly poté kultivovány v médiu obsahujícím PDGF-BB a Dkk2, které indukovaných buněk k získání šestihranné vzhled a vyjádřit molekulární markery CEC buněk . Důležité je, že buňky by mohly vklad kolagen vytváří in vitro-generované DM a vyjádřil hlavní složky rohovky endoteliální čerpadlo funkce, jako jsou Na+, K+ATPasea1 . Ačkoli slibný, funkční aspekt těchto buněk podobných CEC odvozených od PSC čeká na další zkoumání. Některé kritické budoucí otázky zahrnují schopnost těchto PSC-odvozené CEC-jako buňky fungovat jako děravý bariéry a udržení stavu dehydratace rohovky, jakož i zkoumání jejich in vivo terapeutický potenciál.