Bakteriofágy, také zvané bakteriofágy jsou viry, které specificky infikovat bakterie a můžeme potvrdit jejich přítomnost a je kvantifikovat pomocí nástroj nazvaný plaku testu. Bakteriofágy infikují své citlivé hostitele tím, že se nejprve připojí k bakteriální buněčné stěně a vstříknou svůj genetický materiál. Pak, oni unést buňky biosyntetické stroje k replikaci jejich DNA a produkovat četné potomstvo fágové částice, které jsou pak vydání lysing a zabíjení hostitelské buňky.

tato lytická aktivita je základem široce používané techniky vyčíslování fágů známé jako test plaku nebo test dvojité agarové vrstvy. Zde se nejprve připraví směs bakteriofágů v roztaveném živném bujónu obsahujícím agar s nízkou koncentrací. Všechny bakterie použité v mixu by měla být naživu a aktivně se dělící v log fázi jejich růstu, který zajistí, že velké procento jsou bakterie životaschopné a schopné vytvořit hustý trávník kolem plaky. Dále se tato roztavená směs bakteriálního fágového agaru rozloží na pevnější, koncentrované agarové živné médium, které je již ztuhlé na Petriho misce. Při inkubaci při pokojové teplotě také vývar agar-fág-bakterie s nízkou koncentrací ztuhne a vytvoří měkké překrytí agaru.

bakteriální buňky lze odvodit další živiny od spodní vrstvy a měla by se rychle množí produkovat splývající trávník bakterií. Protože jsou však fágové částice přítomny také v měkké vrstvě, infikují a replikují svůj genetický materiál v bakteriích, což vyvrcholí lýzou buněk, která uvolňuje více potomků. Tyto potomky fágů pak infikují sousední buňky, protože polotuhý stav vrstvy bakterií-fág omezuje jejich pohyb na vzdálenější hostitelské buňky. Tento cyklus infekce a lýzy pokračuje v několika kolech a zabíjí velké množství bakterií v lokalizované oblasti. Vliv sousední buňky jsou zničeny, je vyrábět jeden kruhový jasné zóna, tzv. plak, který může být vidět pouhým okem, účinně zesiluje bakterie lytické aktivity nemoci a umožnit jejich výčet.

počet plaků na Petriho misky se označují jako plaky-Tvořící Jednotky, nebo PFUs, a poskytuje počáteční bakteriofága koncentrace byla dostatečně ředit, by měl přímo odpovídat počtu infekčních fágových částic v původním vzorku. Tato technika může být také použita pro charakterizaci morfologie plaku, pro pomoc při identifikaci typů fágů nebo pro izolaci mutantů fága. V této laboratoři se naučíte, jak provést test plaku pro výčet fágů, jako příklad použijte fág T7 E. coli.

nejprve určete vhodné médium pro kultivaci hostitelských bakteriálních buněk a bakteriofága. Zde lysogeny vývar, nebo LB médium, byl použit pro kultivaci E. coli a fág T7. Dále vezměte tři čisté skleněné lahve a označte je médiem, názvem a pak první jako LB-vývar, druhý jako LB-Spodní Agar a třetí jako LB-Horní Agar. Nyní, zvážte čtyři gramy předem formulovaného prášku LB ve třech sadách a poté přeneste jednu sadu vážených sušených médií do každé láhve. Do první láhve přidejte 200 mililitrů vody. Obsah promíchejte pomocí magnetické míchací tyče.

potom pomocí pH metru a za stálého míchání přiveďte konečné pH na 7,4 přidáním hydroxidu sodného nebo kyseliny chlorovodíkové. Opakujte přidání vody a úpravu pH pro další dvě zbývající lahve. Nyní zvážte tři gramy agarového prášku a přidejte jej do druhé láhve, abyste vytvořili 1,5% spodní agar. Nakonec zvážíme 1. 2 g agaru a přidejte ji do třetí láhve, aby se .6% LB horní agar. Stav vývaru v láhvi nepotřebuje přídavek agaru. Uzavřete láhev semi-pevně a poté sterilizujte médium autoklávováním při 121 stupních Celsia po dobu 20 minut. Po dokončení vyjměte lahve s médiem z autoklávu a okamžitě otočte uzávěry lahví, abyste je úplně uzavřeli, aby nedošlo ke kontaminaci. Uchovávejte LB-vývar a LB-Top agarové médium na lavičce pro pozdější použití. Umístěte agar LB-Bottom, aby se ochladil ve vodní lázni, která je přednastavena na přibližně 45 stupňů Celsia.

když agar LB-Bottom dosáhne přibližně 45 stupňů Celsia, přeneste jej na pracovní stůl. Dále sterilizujte pracovní prostor pomocí 70 % ethenolu. Dále přidejte 450 mikrolitrů sterilního jednoho molárního chloridu vápenatého do roztaveného spodního agaru, aby se vytvořila konečná koncentrace 2.25 milimetrů. Jemně kroužte lahvičkou, aby se promíchala. Poté položte sedm čistých Petriho misek. Označte každou misku na dně názvem média a datem přípravy. Poté nalijte 15 mililitrů spodního agaru do každé ze sedmi Petriho misek. Nechte desky nastavit několik hodin nebo přes noc při pokojové teplotě. Po nastavení mohou být kultivační desky v případě potřeby skladovány při čtyřech stupních Celsia několik dní, vzhůru nohama, aby se minimalizovala kondenzace. Přeneste Petriho misky z chladničky o čtyřech stupních Celsia do inkubátoru 37 stupňů Celsia jednu hodinu před testem.

den před provedením testu by měla být E. coli kultivována. Zde bylo naočkováno 10 mikrolitrů kultury E. coli do 10 mililitrů LB-vývaru. Místo, kde bakterie rostou přes noc v třepací inkubátor nastavte na 37 stupňů Celsia, při 160 OT / min. Poté v den testu odstraňte bakteriální kulturu z inkubátoru. Osivo čerstvé 10 mililitrů čerstvého LB vývaru s 0, 5 mililitry noční kultury. Tyto buňky rostou do třepací inkubátor nastavte na 37 stupňů Celsia, při 160 OT / min. Dále použijte spektrofotometr ke kontrole, kdy tato kultura dosáhne růstu log fáze, což je indikováno optickou hustotou 0, 5 až 0, 7. Jakmile OD dosáhne této úrovně, zastavte inkubaci přenesením buněčné kultury na lavičku. Nyní jsou připraveny k použití pro fágový překryvný test.

titry fágů se mohou exponenciálně lišit v různých typech a vzorcích fágů. Aby bylo možné je efektivně spočítat, měly by být zředěny, aby se vytvořil široký rozsah koncentrací fágů. V den testu, vytvářet sérii ředění fága v rozmezí od jedné desetiny do jedné miliontiny koncentrace, po 10-násobném ředění technika. Chcete-li získat statisticky významné a přesné údaje, proveďte sériové ředění ve trojím vyhotovení.

poté roztavte ztuhlý agar LB-top pomocí mikrovlnné trouby. Poté ji umístěte do vodní lázně, která je přednastavena na 45 stupňů Celsia po dobu jedné hodiny. Po jedné hodině sbírejte Petriho misky obsahující spodní vrstvu agaru z inkubátoru. Označte destičky koncentrací fágu a datem testu. Poté nastavte sedm čistých zkumavek. Označte každou zkumavku sériovým ředicím číslem fágu a označte ji jako kontrolní.

když agar LB-top dosáhne 45 stupňů Celsia, přeneste jej na pracovní stůl. Nyní, přidejte 450 µl jednoho molárního chloridu vápenatého na 200 ml agaru, aby se konečná koncentrace 2,25 millimolar. Jemně kroužte lahvičkou, aby se promíchala. Dále přidejte 35 mililitrů LB-top agaru a čtyři mililitry bakteriální suspenze do sterilní kónické zkumavky. Jemně kroužte, abyste rovnoměrně rozložili buňky, ale vyhněte se třepání, aby nedošlo k pěnění.

nyní alikvotujte pět mililitrů této směsi bakteriálního agaru do každé ze sedmi zkumavek. Pak přeneste 100 µl ze sériově naředěn bakteriofága vzorky a kontroly médií, která by měla být jednoduše médií bez bakteriofága, uctivě označené zkumavky. Jemně kroužte směsí, abyste zajistili správné promíchání. Jemně přeneste pět mililitrů směsi bakteriofágů na příslušnou Petriho desku. Rovnoměrně rozložte směs po celém povrchu jemným kroužením Petriho desky.

jakmile jsou všechny Petriho destičky vrstveny směsí, nechte ztuhnout vrchní vrstvu inkubací při pokojové teplotě po dobu 15 minut. Po dokončení těchto kroků opakujte postup pro druhou a poté třetí sadu Petriho misek pomocí zbývajících dvou sad ředění fágů. Každou misku uzavřete parafilmem a inkubujte při pokojové teplotě po dobu 15 minut. Umístěte kultivační desku dnem vzhůru při vhodné teplotě po dobu 24 hodin nebo dokud se nevyvinou plaky. Zde byly desky umístěny do inkubátoru 37 stupňů Celsia na jeden den, což je stimulační růstový stav pro e. coli a fág T7.

plaky se objeví po jednom až pěti dnech inkubace, v závislosti na bakteriálních druzích, inkubačních podmínkách a volbě média. Zde byly plaky viditelné po jednom dni inkubace při 37 stupních Celsia. Začněte kontrolou desek označených kontrolou a ujistěte se, že v těchto deskách nebyly vytvořeny žádné plaky, protože by to znamenalo virovou kontaminaci. Pro stanovení titru fága v původním vzorku, začneme s deskami obsahující nejvíce zředěného vzorku fága první a počítat plakety bez odstranění víka, značení nich uveďte, které z nich již byly spočítány. Opakujte počítání pro každou desku v každé sadě. Některé desky mohou mít příliš mnoho nebo příliš málo plaket, které lze spočítat. Zvažte 10 až 150 jako ideální počet plaků.

dále Vygenerujte tabulku se seznamem hodnot počtu plaků pro různá ředění a replikace. Poté Vypočítejte průměrné hodnoty počtu plaků pro ředicí desky, které obsahovaly ideální počet plaků. V tomto příkladu se jednalo o průměrný počet plaků vytvořených v rozmezí 10 až minus tři a 10 až minus čtyři ředicí destičky. Nyní upravte faktor ředění fága vydělením získaných středních hodnot plaku příslušnými faktory ředění fága. Tady, průměrný počet plaků vytvořených na 10 na minus tři a 10 na minus čtyři ředicí desky, byly rozděleny podle jejich příslušných faktorů ředění získat počet plak tvořících jednotek, nebo PFUs, v 100 mikrolitrů fágové směsi. Převést hodnotu PFU / ml, násobit vygenerované hodnoty o 10, protože pouze 100 µl z ředění fága mix byl použit během bakteriofága překrytí kroku přípravu, výrobu další faktor ředění 10. Nakonec Vypočítejte průměr hodnot získaných z různých ředicích destiček. Tím se získá průměrný počet PFU na mililitr. Počet PFU odpovídá počtu infekčních fágových částic v původním vzorku.