androgenní receptor (AR) je členem steroidní hormon jaderný receptor nadčeleď, který obsahuje estrogen, progestin, glukokortikoidní a mineralokortikoidní receptory.1 vázání typický, endogeneously produkované androgeny testosteron (1) a důležitý aktivní metabolit dihydrotestosteron (2) AR iniciuje pozoruhodně rozmanité spektrum biologických aktivit, které se může lišit podle subjektu pohlaví, věk a hormonální stav. Činnost AR je rozhodující pro normální lidské sexuální vývoj a funkci, ale za tento podpis roli, AR aktivace má také významné účinky na rozmanité cíle, jako jsou kosti, játra, sval a centrální nervový systém.2,3 terapeutický potenciál androgenní signalizace je dobře-ocenil v medicinální chemie společenství, a pro docela nějaký čas, chemici hledali látky, které selektivně stimulují růst svalů a kostí a zároveň minimalizuje proliferační a/nebo hypertrofické účinky na sex tkání, jako je například prostaty u mužů a klitorisu u žen.4,5 takové sloučeniny byly nazývány selektivní modulátory androgenních receptorů nebo SARM. V tomto ohledu je prototypový a endogenní androgen, testosteron, považován za logický srovnávací srovnávač. Sloučenina 3 je GTx SARM S-22 a sloučeniny 4 je BMS SARM 562929, z nichž oba byly hlášeny v literatuře jako perorálně aktivní sloučeniny s selektivity pro svalové nad prostaty vzhledem k testosteronu v různých preklinických modelech.6,7

možnost získání sloučeniny s tkáňově selektivní činnosti, které jsou odlišné od endogenní referenční hodnoty testosteronu mohou vyplývat ze skutečnosti, že typické AR aktivace receptoru, které je iniciováno vazba molekuly s afinitou pro AR k AR ligand vazebnou doménu, následuje spíše pozoruhodné, koordinované série interakcí: Ty mohou zahrnovat změnu v receptoru topologie, disociace heat shock proteinů, receptorů dimerizace, fosforylace receptoru, rapid-signalizační události, translokace do jádra (AR), asociace s mnoha různými coregulatory proteiny tvoří transkripční komplex, který vede k aktivaci nebo potlačení syntézy RNA z AR-modulovaný geny, a konečně degradace receptoru.8 protože každá topologie komplexu receptor-ligand je pro tuto strukturu ligandu jedinečná, lze ocenit, že interakce jakéhokoli konkrétního komplexu ligand-receptor s koregulačními proteiny bude pravděpodobně jedinečná i pro tento ligand. Kromě toho, protože hladina exprese AR, souhvězdí a vyjádření úrovně coregulatory proteiny, a vzory post-transkripční regulační událostí se liší v každém typu androgen cílových buněk, a topografii AR regulačních míst v genomu se liší u každého genu, tento pozoruhodný choreografie akcí a interakcí poskytuje bohaté prostředí, ve kterém člověk mohl hledat Sarm mít žádoucí vzorek tkáně-selektivní farmakologie, jako jsou vysoké anabolické ale omezené androgenní aktivity.

dále komplikuje naše chápání původu selektivity SARM je „bio-amplifikace“ primárního endogenního androgenního testosteronu. Zajímavé je, že endogenně vyrobené a velmi důležité androgen testosteron slouží jako typ „anti-SARM“ nebo „inverzní SARM“, protože jeho androgenní aktivita je zvýšena konverze na silnější 5α-dihydrotestosteron na 5α-reduktázy enzymu v některých tkání, včetně pokožky hlavy a prostaty (ale ne ve svalu nebo kosti). Jako výsledek, androgeny, které nejsou podrobeny takové bioamplification v prostatě bude demonstrovat lepší selektivitu, pokud jde svalové vs prostaty, kdy ve srovnání s testosteronem léčených kontrolu nebo intaktní zvíře, jehož hlavní endogenní androgen je testosteron.9 obecněji řečeno, lze ocenit, že metabolické rozdíly mezi endogenními androgeny, jako je testosteron nebo dihydrotestosteron a SARM, mohou také zaručit alespoň některé rozdíly v selektivitě.

naše práce v oblasti SARM vyústila v syntézu a vyhodnocení velkého počtu kandidátských šablon. I když jsme zjistili, že je relativně snadné získat sloučeniny s vysokou afinitou k AR, snažili jsme se dosáhnout sloučenin, které prokázaly dobrou orální účinnost a vysokou snášenlivost in vivo. Po skenování mnoha potenciálních potenciálních zákazníků pro orální aktivitu in vivo jsme dospěli k vysoce afinitní sloučenině 5 kombinací syntetického meziproduktu testování, hodnocení literatury a kombinace fragmentů. Byli jsme potěšeni, když 5 prokázal orální aktivitu u potkanů.

Nicméně, když jsme se provádí farmakokinetické analýzy u potkanů, bychom mohli detekovat pouze velmi nízké hladiny 5 po perorálním podání (F < 5%). Další analýza ukázala, že 5 byl účinně převeden na 6in vivo, pravděpodobně cytochromy P450 v játrech potkanů.10 sloučenina 6 měla podobnou aktivitu jako sloučenina 5in vivo, což naznačuje, že 6 byl z velké části zodpovědný za aktivitu sloučeniny 5.11 in vitro obrazovky s lidskými mikrozómy prokázaly, rychlý metabolismus sloučeniny 5, což naznačuje tuto transformaci jako potenciální lidské metabolické odpovědnosti a vyzve nás k přípravě sloučenin, v nichž 4′-pozici přívěsek fenyl byl zablokován z P450-indukované hydroxylace.12 podívali Jsme se na několik analogů obsahující 4′-blokování skupiny, a v průběhu našeho úsilí, které jsme identifikovali sloučenina 7 (RAD140; Obrázek 1)1) jako naše preklinickém vývoji kandidáta.

syntéza sloučeniny 7 je ukázáno ve Schématu 1.13,14 spoléhali Jsme na rychlé, ipso-fluor nahrazení levé straně předchůdce, kus 8, s d-threonin v přítomnosti K2CO3 v DMSO se získá požadovaný produkt 9 funkční výnosy (typicky >50%). Addukt 9 d-Thr byl spojen s 4-kyanobenzohydrazidem za standardních podmínek vazby za použití EDCI a HOBt. Výsledný produkt 10 byl silylován TBDMS-Cl, podroben dehydratačním cyklizačním podmínkám v přítomnosti TPP / I2 a poté desilyován pro poslední krok.15-17 celkově se ukázalo, že se jedná o spolehlivou a účinnou syntézu s použitím poměrně levné, i když neproteinogenní aminokyseliny jako zdroje chirality.

stabilita RAD140 byla vysoká (t1/2 > 2 h) při inkubaci s krysa, opice a lidské mikrosomy, a to také měl dobré biologická dostupnost u potkanů (F = 27-63%) a opic (65-75%). RAD140 prokázal vynikající afinitu k androgen receptor (Ki = 7 nM vs 29 nM pro testosteron a 10 nM pro DHT), stejně jako dobré selektivity oproti jiným steroidní hormonální nukleární receptory, s nejbližšími mimo cílový receptor, že progesteron receptor (IC50 = 750 nM vs 0.2 nM pro progesteron).18v vitro funkční agonistou androgenů aktivita byla potvrzena v C2C12 osteoblastické diferenciace testu, kde EC50 0,1 nM bylo prokázáno (DHT = 0.05 nM).19

RAD140 byl charakterizován v řadě in vivo testů pro stanovení jeho orální účinnosti na řadě parametrů spojených s androgenní aktivitou v preklinických modelech. Například, RAD140 byl dávkován v obou mladý kastrovaný a neporušené samců potkanů, s cílem posoudit její účinky prostřednictvím řady endogenní androgenní signalizace pozadí. Mladé kastrované krysy poskytuje velmi citlivé in vivo pro androgenní aktivity, protože zvíře je poměrně androgen-naivní; tedy jakékoli signalizace činnosti z exogenně podávané androgeny je položený na v podstatě prázdné pozadí.20 na obrázku obr. 2, 2, účinek zvyšujících se dávek perorálně podávaného RAD140 (0 .5% metylcelulóza) na m. levator ani m. bulbocavernosus svalu („m. levator ani“, nebo „LABC“) hmotnost a hmotnost prostaty je znázorněno ve vztahu k vozidlu (kastrovaný control), sham (noncastrated ovládání), a testosteron propionát (TP), kterým byl podáván subkutánně v dávce 1 mg/kg v kukuřičném oleji.21 Jak je vidět, RAD140 stimuluje levator ani svaly počátku v dávce 0,03 mg/kg (po) a dosáhne úrovně účinnosti ekvivalentní sham-operovaných zvířat na 0,3 mg/kg.

Protože my jsme důsledně zjištěno, že RAD140 nepodařilo dosáhnout úrovně prostaty nebo semenných váčků stimulace rovná TP na 1 mg/kg (nezáleží na tom, jak vysoká dávka RAD140), jsme se rozhodli otestovat, zda RAD140 může antagonizovat účinek TP na potkana prostaty a semenných váčků a, ve stejné době, určit, jaký vliv současného podání RAD140 a TP by to mohlo mít na levator ani svaly. Z výsledků je znázorněno na Obrázku Obrázek 3,3, je zřejmé, že vysoké dávky RAD140 (10 mg/kg, po), ve skutečnosti působí proti účinku TP na 1 mg/kg na semenných váčků, ale přidává k účinku TP na levator ani svaly. Byli jsme schopni zjistit, že účinná dávka pro dosažení antagonismu RAD140 je 0,3-1 mg / kg (po) pro 1 mg / kg TP (sc) (údaje nejsou zobrazeny). V prostatě RAD140 také způsobil klesající trend stimulace TP, ale změna nedosáhla statistické významnosti. Tak, v mládí vykastrovat samce potkana model, RAD140 se zdá být silný a kompletní agonistou androgenů na m. levator ani, ale slabší, částečný antagonista na semenných váčků a pravděpodobně prostaty.22

cílem většiny preklinických modelů in vivo je nejlépe předpovědět, jak bude lék fungovat v cílové populaci léčiv. Při zvažování otázky, jak stimulační androgen je na dané tkáně v preklinických model, jeden by měl mít na paměti, že úroveň pozadí androgenní signalizace může ovlivnit odpovědi pozorované u zvířat. Model kastrovaných potkanů má omezení, protože velmi nízká endogenní hladina androgenu v tomto modelu je umělá situace, která se neodráží v cílové dospělé lidské mužské populaci.23 zejména Cílová mužská populace bude mít androgenní pozadí výrazně nad kastrátem, i když hladiny androgenu budou pravděpodobně nižší než norma pro jejich skupinu.

abychom lépe porozuměli tomu, jak by tato skupina mohla reagovat, rozhodli jsme se podívat na mladé neporušené samce potkanů, protože mají endogenní testosteron, ale v poněkud snížených hladinách. Proto si zachovávají citlivost prostaty na androgenní sloučeninu, ale zároveň mají základní stimulaci, která je více podobná cílové populaci než kastrovaná zvířata. Jak je znázorněno na obrázku obr. 4,4, RAD140 zvýšil hmotnost svalu levator ani nad hmotnost intaktní kontroly počínaje nejnižší zkoušenou dávkou (0, 1 mg / kg). Je zajímavé, že RAD140 neprokázal žádnou stimulaci prostaty nad intaktní kontrolní hladinou zvířat až do nejvyšší testované dávky 30 mg / kg. Na 0,3 mg/kg, RAD140 prokázána účinnost svalové podobné TP na 0,5 mg/kg, ale v dávce 30 mg/kg RAD140 bylo požadováno, aby přibližné prostaty účinnost 0,5 mg/kg TP.24 Z této studie je zřejmé, že v mladé neporušené samců potkanů RAD140 má velmi široký rozsah relativní selektivita k oběma TP-léčených potkanů, stejně jako sham-kontrolní potkani.

a Konečně jsme se zajímali o hodnocení vlivu RAD140 v mladé, mužské cynomolgous opice stanovit účinné dávkování úrovně v co považujeme za více relevantní předklinické druhů. Provedli jsme relativně jednoduchou, neterminální studii, která nám stále umožnila vyhodnotit anabolické i lipidové a další parametry klinické chemie. K posouzení anabolické aktivity jsme se nejprve podívali na hrubou tělesnou hmotnost, o které jsme věděli, že je citlivým markerem anabolického androgenního účinku u mladých nelidských primátů. Výsledky na zvířecím těle, hmotnost 28-denní dávkování s RAD140 0.01 mg/kg 0,1 mg/kg a 1 mg/kg, jsou uvedeny na Obrázku Figure55.

Vzhledem k malé velikosti skupiny (n = 3 pro každé dávkovací skupině), využili jsme každé zvíře pozadí změny hmotnosti pro týdny před experimentem stanovit jako základní ovládací prvek. Vzhledem k průměrné tělesné hmotnosti pro každou skupinu tři opice konvergované téměř identické číslo (den -1), s absolutní rozpětí tělesné hmotnosti mezi skupinami pouze 4.26−4.29 kg, jsme vyneseny absolutní tělesné hmotnosti na Obrázku Figure5.5. V této studii byl průměrný přírůstek hmotnosti větší než 10% za pouhých 28 dní dávkování bylo dosaženo při dávce 0,1 mg/kg, přičemž podobný efekt pozorován na 1.0 mg/kg dávkování skupiny.26

Dual energy X-ray absorpciometrie („DEXA“) skenuje všechny opice byly pořízeny dva dny před podáním začaly a jeden den po poslední dávce (den 2 a den 29) za účelem zjištění účinků RAD140 na libové tkáně a tuku; výsledky jsou uvedeny na Obrázku Figure6.6. Jak je vidět, neexistoval konzistentní účinek na absolutní tukovou hmotu, zatímco sval vykazoval kvalitativní trend, který se zvyšuje s dávkou. I když se zdá, že většina hmoty zvýšení znázorněno na Obrázku Figure55 byl kvůli štíhlé hmoty zvýšení, žádný z tkáně zvyšování hmotnosti byly velmi statisticky významný (p > 0.05), což by mohlo být vzhledem k malé velikosti skupiny (n = 3) a poměrně velké směrodatné odchylky.27