Složení a Antimikrobiální Aktivitu Euphrasia rostkoviana Hayne Esenciální Olej

Abstrakt

Světlík, Euphrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae), je léčivá rostlina tradičně používá v Evropě pro léčbu různých zdravotních poruch, zejména jako oční kapky k léčbě očních onemocnění, jako je zánět spojivek a zánět očního víčka, které mohou být spojeny s bakteriální infekcí. Některé druhy Euphrasia byly dříve hlášeny obsahovat esenciální olej. Složení a bioaktivita oleje e. rostkoviana však nejsou známy. Proto v této studii jsme zkoumali chemické složení a antimikrobiální aktivitu z heřmánku esenciální olej proti některé organismy spojené s oční infekce: Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Pseudomonas aeruginosa a Candida albicans. GC-MS analýza odhalila více než 70 složek, s n-hexadekanové kyseliny (18.47%) jako hlavní složku následuje thymol (7.97%), kyseliny myristové (4.71%), linalool (4.65%), a anetholu (4.09%). Esenciální olej vykazoval antimikrobiální účinek proti všem testovaným organismům s výjimkou P. aeruginosa. Nejlepší aktivita byla pozorována u všech testovaných grampozitivních bakterií s minimálními inhibičními koncentracemi 512 µg / ml. Toto je první zpráva o chemickém složení esenciálního oleje e. rostkoviana a jeho antimikrobiální aktivitě.

1. Úvod

Světlík, Euphrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae), byl používán v Evropě po staletí jako tradiční medicíně pro léčbu různých onemocnění. Odvary a odvary z kvetoucích nadzemních částí se používají proti suchý kašel, chrapot, symptomatická léčba nachlazení, bolest ucha, bolest hlavy, senná rýma, hnisavé kožní léze, nebo katarální onemocnění střevního traktu, ale zejména jako oční kapky k léčbě a prevenci očních onemocnění, jako je zánět spojivek, zánět očního víčka, únava očí, hnisavý oční zánět, a chlévy . Použití čaje s očima bylo také hlášeno v etnoverinární medicíně k léčbě infekce kravského oka . I přes staletí tradiční použití pro léčení očních onemocnění, tam byl jen jeden prospektivní kohortní studii provádí potvrzující účinnost Euphrasia oční kapky při léčbě zánět spojivek a jediná klinická studie, která zkoumala vliv lokální aplikace očních kapek na spotřeba antibiotik u novorozenců . Navíc až do nedávných zpráv o antikandidní a antibakteriální aktivitě některých extraktů Eufrazie bylo spektrum antimikrobiálního účinku zcela neznámé.

terapeutický účinek e. rostkoviana může být přičítána hlavně jeho antioxidační, protizánětlivé a antimikrobiální aktivitě . Mezi sloučeniny, dříve identifikován u E. rostkoviana výtažky , apigenin, luteolin, kaempferol, quercetin, kyselina kávová, kumarová kyselina a kyselina rozmarýnová může být zodpovědná za antimikrobiální účinek. Ačkoli byla dříve hlášena přítomnost éterického oleje (EO) v e. officinalis L. A E. stricta Kunt, složení a bioaktivita e. rostkoviana EO nejsou známy. Proto v této studii jsme zkoumali chemické složení a antimikrobiální aktivitu světlík EO proti panelu tři Gram-pozitivní bakterie (Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus a S. epidermidis) a tři Gram-negativní bakterie (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae a Pseudomonas aeruginosa) a kvasinek (Candida albicans), organismy běžně spojené s oční infekcí.

2. Materiál a metody

2.1. Chemické látky a Rostlinného Materiálu

závazné normy, borneol, kafr, karvakrol, karvon, karyofylen, p-cymen, estragol, eukalyptol, limonen, linalool, mentol, menthon, β-myrcen, γ-terpinen, a thymolu na EO součásti identifikace, stejně jako ovládání antibiotik ciprofloxacinu a tioconazole byly zakoupeny od Sigma-Aldrich (Praha, česká Republika). Hexan (Merck, Praha, čr), dimethylsulfoxid (DMSO) (Lach-Ner, Neratovice, česká Republika) a Tween 80 (Sigma-Aldrich, Praha, česká Republika) byly použity jako rozpouštědla. Rostlinný materiál používaný pro destilaci EO byl zakoupen z komerčních zdrojů (F-DENTAL, Hodonín, Česká republika). EO byl extrahován hydrodestilací pomocí zařízení typu Clevenger.

2.2. Chemická Analýza EO pomocí Plynové Chromatografie-Hmotnostní Spektrometrie (GC-MS)

E. rostkoviana EO byl analyzován pomocí GC-MS s použitím Agilent 7890A GC spolu s Agilent 5975C single-kvadrupólové hmotnostní detektor vybaven HP-5MS kolona (30 m × 0,25 mm, 0.25 µm filmu) od Agilent (Santa Clara, CA, USA). Hexan byl použit jako rozpouštědlo a vzorek o objemu 1 µL byl aplikován v režimu split (poměr 20 : 1) do injektoru vyhřáté na 250°C. výchozí teplota sušárny byla nastavena na 60°C po dobu 3 min, naprogramovaný do 230°C rychlostí 3°C/min, a pak se udržuje konstantní po dobu 10 min. Helium bylo použito jako nosný plyn s průtokem 1 mL / min. MS analýza byla provedena v režimu plného skenování a elektronová ionizační energie byla nastavena na 70 eV. Identifikace jednotlivých komponent byla založena na srovnání jejich hmotnostní spektra a relativních retenčních indexů s Národním Institutem pro Standardy a Technologie Knihovna (NIST, USA) a literatury , stejně jako coinjection autentické standardní.

2.3. Bakteriální Kmeny a Kultivační Média

standardní kmeny tři Gram-pozitivní bakterie Enterococcus faecalis ATCC 29212 Staphylococcus aureus ATCC 29213, a. S. epidermidis ATCC 12228, tři Gram-negativní bakterie Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, a Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 a jeden kvasinky Candida albicans ATCC 10231 byly získány z Oxoid (Basingstoke, Spojené Království). Kation upravena Mueller-Hinton bujón (MHB) a Sabouraud dextróza vývar (SDB) byly použity jako kultivační média pro antibakteriální a antimykotické microdilution testu, respektive, a byly uvedeny do rovnováhy s Tris-pufrovaný fyziologický roztok (Sigma-Aldrich, Praha, česká Republika). K následnému stanovení baktericidních a fungicidních koncentrací byly použity Mueller-Hinton agar (MHA) a Sabouraud dextrózový agar (SDA). Všechna média byla zakoupena od společnosti Oxoid (Basingstoke, Spojené království).

2.4. Minimální Inhibiční Koncentrace (MIC) Stanovení

Mikrofony byly stanoveny pomocí in vitro vývar microdilution metoda následující pokyny Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) upravený podle doporučení navržená pro efektivní posouzení anti-infekční potenciál přírodních produktů pomocí 96jamkové mikrotitrační destičky. Krátce, EO byl rozpuštěn v DMSO s přídavkem Tween 80 a dvou-násobné ředění byly připraveny v MHB pro bakterie a v SDB pro kvasinky vzhledem k tomu, že koncentrace se pohybovaly od 4 až 2048 µg/mL. Inokulum bylo připraveno z noční kultury tak, že počáteční koncentrace CFU v mikrotitrační destičky byly 5 × 105 2 × 103 CFU/mL pro bakterie a kvasinky, resp. Naočkované destičky byly vyšetřeny po 24 hodinách inkubace při 35°C a ještě jednou po 48 hodinách v případě C.albicans. Mikrobiální růst byl měřen spektrofotometricky pomocí Multiscan Ascent Fotometr na mikrotitrační destičce (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) při 405 nm. Mic byly vyjádřeny jako nejnižší koncentrace schopné inhibovat ≥ 80% růstu bakterií ve srovnání s pozitivní kontrolou růstu. Experimenty byly provedeny ve trojím vyhotovení ve třech nezávislých testech a pro výpočet Mic byly použity střední hodnoty. Vzhledem k nedávno oznámil možnost EO těkavé složky‘ vliv na mikrobiální růst v sousedních studní , pozitivní růst kontrolu řádky byly vloženy mezi EO ředění řádky odhalit případný růst vliv. Použitá rozpouštědla neinhibovala růst bakterií při testovaných koncentracích. Ciprofloxacin a tiokonazol byly použity jako referenční antibiotika pro bakterie a kvasinky.

2.5. Minimální Baktericidní Koncentrace (MBC) a Minimální Fungicidní Koncentrace(MFC) Stanovení

alikvotní podíl 20 µL byly převedeny od sebe i bez mikrobiálního růstu na MHA desky (SDA desky pro C. albicans) po 24 h a 48 h inkubace bakterií a kvasinek testovány, respektive. Destičky byly poté inkubovány po dobu 24 hodin při 35°C. MBC a MFC byly hodnoceny jako ≥99,9% pokles CFU ve srovnání s inokulem, všechny byly provedeny ve třech nezávislých testech.

3. Výsledky a diskuse

3.1. Chemická Charakteristika Olejů a Bioaktivních Frakcí, Složek

EO hydrodistillation tím, Clevenger-typ přístroje přinesly 0.02% (w/v) žluto-hnědý olej, který má tendenci tuhnout při pokojové teplotě, která je pravděpodobně způsobena vysokým podílem mastných kyselin (32.23% celkem). GC-MS analýza EO odhalil přítomnost více než 70 složek, s palmitové kyseliny (18.47%) je nejhojnější složkou následuje thymol (7.97%), kyseliny myristové (4.71%), linalool (4.65%), anetol (4.09%), kyselina linolenová (3.81%), hexahydrofarnesyl aceton (3.16%), kyselina laurová (2.79%), α-terpineol (2.39%), and borneol (2.39%). The main compounds are shown also in the chromatogram (Figure 1) and the complete list of EO constituents is presented in Table 1.


Peak number	Component	RI	Area (%)	ID	Peak number	Component	RI	Area (%)	ID

1	1-Hexanold	—	0.10	a	41	Damascenone	1385	0.56	a, b
2	1-Octen-3-ol	981	1.82	a, b	42	Methyl eugenol	1406	0.23	a, b
3	β-Myrcene	992	0.14	a, b, c	43	Caryophyllene	1419	1.28	a, b, c
4	3-Octanol	996	0.13	a, b	44	Geranyl acetone	1455	0.89	a, b
5	p-Cymene	1027	0.81	a, b, c	45	Trans-β-farnesene	1460	0.13	a, b
6	Limonene	1032	0.34	a, b, c	46	Alloaromadendrene	1462	0.12	a, b
7	Eucalyptol	1034	0.25	a, b, c	47	γ-Muurolene	1478	0.25	a, b
8	γ-Terpinene	1062	0.34	a, b, c	48	Germacrene D	1482	0.31	a, b
9	Sabinene hydrate	1070	0.14	a, b	49	Curcumene	1484	1.21	a, b
10	1-Octanol	1074	0.40	a, b	50	Trans-β-ionone	1487	1.53	a, b
11	3,5-Octadienoned	1094	0.16	a, b	51	Valencene	1493	0.13	a, b
12	Linalool	1101	4.65	a, b, c	52	α-Selinened	1495	0.17	a, b
13	α-Thujone	1106	0.88	a, b	53	Epizonarened	1498	0.26	a, b
14	β-Thujone	1118	0.48	a, b	54	α-Muurolene	1500	0.18	a, b
15	Camphor	1146	1.00	a, b, c	55	β-Bisabolene	1510	0.94	a, b
16	Menthone	1156	1.98	a, b, c	56	γ-Cadinene	1515	0.40	a, b
17	2-Nonenal, (E)-	1163	0.10	a, b	57	Nerolidold	1566	0.10	a, b
18	Borneol	1168	2.39	a, b, c	58	Lauric acid	1574	2.79	a, b
19	(+/−)Lavandulol	1170	0.16	a, b	59	Spathulenol	1578	0.61	a, b
20	Menthol	1175	2.02	a, b, c	60	Caryophyllene oxide	1583	1.47	a, b
21	4-Terpineol	1179	1.13	a, b	61	Pseudoiononed	1587	0.18	a, b
22	α-Terpineol	1191	2.39	a, b	62	Humulene epoxide II	1609	0.25	a, b
23	Estragole	1199	0.34	a, b, c	63	Longifolenaldehyded	1613	0.20	a, b
24	Decanal	1207	0.15	a, b	64	τ-Cadinol	1643	0.18	a, b
25	β-Cyclocitrald	1222	0.21	a, b	65	β-Eudesmol	1651	0.13	a, b
26	Thymol methyl ether	1238	0.75	a, b	66	Myristic acid	1771	4.71	a, b
27	Cumin aldehyde	1242	0.23	a, b	67	Hexahydrofarnesyl acetone	1847	3.16	a, b
28	Neral	1244	0.14	a, b	68	Pentadecanoic acid	1865	0.28	a, b
29	Carvone	1246	1.28	a, b, c	69	Farnesyl acetone	1919	0.50	a, b
30	Piperitone	1256	0.18	a, b	70	Palmitic acid	1977	18.47	a, b
31	Geraniol	1258	0.79	a, b	71	Phytold	2114	0.12	a, b
32	Trans-2-decenald	1264	0.11	a, b	72	Linoleic acid	2143	1.90	a, b
33	Geranial	1273	0.15	a, b	73	Linolenic acid	2148	3.81	a, b
34	Anethole	1287	4.09	a, b	74	Tricosane	2300	1.79	a, b
35	Safrole	1289	0.21	a, b	75	Tetracosane	2400	0.16	a, b
36	Thymol	1295	7.97	a, b, c	76	Pentacosane	2500	1.36	a, b
37	Carvacrol	1304	1.96	a, b, c
38	(E,E)-2,4-Decadienal	1318	0.21	a, b		Total identified		98.91
39	Capric acid	1374	0.26	a, b
40	α-Copaene	1377	0.15	a, b

R: retention indices relative to n-alkanes on HP-5MS capillary column (30 m × 0.25 mm, 0.25 m); peak area relative to total peak area in %; ID: identification method; a: identification based on mass spectra matching; b: identification based on retention index; c: identifikace na základě coinjekce autentického vzorku; d: předběžná identifikace.

Tabulka 1

Chemické složení Euphrasia rostkoviana Hayne esenciální olej.

Obrázek 1

Typický chromatogram Euphrasia rostkoviana esenciální olej. Hlavní komponenty jsou označeny podle pořadí jejich retenčních časů. (12) Linalool; (22) α-terpineol; (34) anethol; (36) thymol; (37) karvakrol; (58) kyselina laurová; (66) kyselina myristová; (67) hexahydrofarnesylaceton; (70) kyselina palmitová; (73) kyselina linolenová.

vysoký obsah mastných kyselin, které již dříve bylo zjištěno, v. E. stricta EO (25.7% celkem), také nejvyšší podíl kyseliny palmitové (20.3%) a kyseliny myristové (3.9%) . Neexistuje však žádná jiná sloučenina přítomná ve významném množství, která by naznačovala příbuznost těchto dvou druhů Eufrazie.

3.2. Antimikrobiální aktivita

E. rostkoviana EO vykazovala aktivitu proti šesti ze sedmi testovaných organismů s Mic v rozmezí od 512 do 2048 µg / ml. Grampozitivní bakterie byly citlivější než gramnegativní bakterie a kvasinky, zatímco P. aeruginosa byl jediný organismus, který nebyl inhibován olejem při nejvyšších testovaných koncentracích. Mic, MBC a MFC EO proti všem testovaným mikroorganismům jsou shrnuty v tabulce 2. Aktivní koncentrace jsou srovnatelné s těmi, které již bylo dříve oznámeno, například, EOs Artemisia annua, Eucalyptus globulus, Mentha suaveolens, Myrtus communis, Ocimum basilicum, nebo Thymus vulgaris, zejména v případě anticandidal činnosti . Olej byl také účinnější než E. rostkoviana výtažky testovány Teixeira a Silva proti E. coli, E. faecalis, S. aureus a S. epidermidis. Mic referenčních antibiotik proti bakteriím a kvasinkám citlivým na e. rostkoviana EO byly v souladu s přijatelnými limity CLSI a předchozími zprávami .


Microorganism	Euphrasia rostkoviana EO					CIP	TIO
	MIC (µg/mL)		IC50 (µg/mL)		MBC/MFC (µg/mL)	MIC (µg/mL)	MIC (µg/mL)
	24 h	48 h	24 h	48 h	24 h	24 h	48 h

Enterococcus faecalis	512	—	128	—	1024	0.5	—
Staphylococcus aureus	512	—	128	—	>2048	0.5	—
Staphylococcus epidermidis	512	—	256	—	>2048	0.25	—
Klebsiella pneumoniae	2048	—	1024	—	>2048	0.125	—
Escherichia coli	2048	—	1024	—	>2048	0.015	—
Pseudomonas aeruginosa	>2048	—	>2048	—	>2048	0.125	—
Candida albicans	128	1024	128	1024	2048	—	0.063

The growth inhibition was measured after 24 h and 48 h of incubation in case of C. albicans; EO: essential oil; CIP: ciprofloxacin; TIO: tioconazole; MIC: minimum inhibitory concentration; IC50: inhibitory concentration causing ≥50% of bacterial growth; MBC: minimum bactericidal concentration; MFC: minimum fungicidal concentration.

Table 2

The inhibitory and cidal concentrations of E. rostkoviana essential oil.

Od obsahu hlavní EO složka kyseliny palmitové nepřesahuje 20%, a tam jsou více než 10 dalších antimicrobially aktivní sloučeniny v rozmezí od 1 do 8%, je obtížné navrhnout hlavních činitelů odpovědných za E. rostkoviana EO antimikrobiální účinek. Kyselina palmitová byla dříve identifikována jako hlavní sloučenina frakcí aktivních proti gramnegativním, ale ne grampozitivním bakteriím . Na druhé straně je známo, že nasycené mastné kyseliny se středním řetězcem a nenasycené mastné kyseliny s dlouhým řetězcem inhibují zejména grampozitivní bakterie . Kyselina laurová navíc působí i proti řadě hub . Tak antimikrobiální aktivita EO je pravděpodobně způsobeno komplexní působení antimikrobiální mastné kyseliny s další dobře známé antimikrobiální sloučeniny, identifikované v EO jako anethol, borneol, kafr, karvakrol, linalool, mentol, α-terpineol, nebo thymol.

4. Závěry

závěrem chemická analýza odhalila řadu antimikrobiálně účinných látek přítomných v e. rostkoviana EO a jeho antifungální a antibakteriální aktivita proti grampozitivním i gramnegativním bakteriím byla potvrzena. Podle našeho nejlepšího vědomí je to první zpráva o složení a antimikrobiální aktivitě e.rostkoviana EO.

střet zájmů

autoři prohlašují, že neexistuje žádný střet zájmů ohledně zveřejnění tohoto příspěvku.

poděkování

tato práce byla finančně podpořena evropskou vědeckou nadací a Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy ČR Project CZ.1.07/2.3.00/30.0040; prostřednictvím S-grantu Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy ČR a projektu IGA 20155012 České Zemědělské univerzity v Praze. Autoři jsou vděční Slavce Barlakové za anglickou korekturu.