dva z nejzajímavějších a nejvšestrannějších genetických nástrojů navržených za posledních 30 let jsou technologie Cre-lox a FLP-FRT. Oba umožňují přísně regulovat umístění a načasování genové exprese. Tento článek stručně popisuje, jak oba systémy fungují a lze je použít v myších modelech.
systém Cre-lox
technologie Cre-lox byla zavedena v 80. letech (Sauer and Henderson 1988; Sternberg and Hamilton 1981) a patentována společností DuPont Pharmaceuticals. Byl úspěšně aplikován v kvasinkách, rostlinách, kulturách savčích buněk a myších (Araki et al. 1987). To je založeno na schopnosti bakteriofága P1 cyclization rekombinace (Cre) rekombinantní interferon gen (cre) efekt rekombinace mezi páry loxP míst. Taková rekombinace u myši“ Cre-lox “ (viz níže) může aktivovat nebo inaktivovat požadovaný gen.
pro použití technologie Cre-lox musí vyšetřovatel vyrobit myš Cre-lox, obvykle chovem myši Cre na myš loxP. Cre myš obsahuje Cre rekombinantní interferon transgenu pod vedením tkáně-specifický promotor; loxP myš obsahuje dvě loxP místa křídlo a genomické segmentu zájmu, „floxed“ locus. Obvykle se myši Cre a loxP vyrábějí pomocí transgenní technologie (Nagy 2000). V závislosti na stimulátorů a dalších regulačních kontrol použitých k jejich výstavbě, Cre myši mohou být navrženy tak, aby vyjádřit Cre rekombinantní interferon pouze za určitých podmínek, včetně následujících: v některých tkáních, když je myší strava doplněna látkami, jako je doxycyklin, tetracyklin, RU486 a tamoxifen (Brocard et al . 1998; Kellendonk et al. 1999; Utomo et al. 1999) a během určitých vývojových fází.
v Závislosti na umístění a orientaci loxP míst v Cre-lox myš, Cre rekombinantní interferon může iniciovat delece, inverze, translokace z floxed locus (Nagy, 2000) (Obr. 1).
Obr. 1.
reakce Cre-lox jsou ovlivněny orientací a umístěním loxp stránek. Spárované loxp místa (trojúhelníky) mají směrovost a mohou být umístěny v uspořádání cis (stejný řetězec DNA) nebo trans (různé řetězce DNA). (A) pokud loxp místa lemují segment DNA (obdélník) v uspořádání cis a jsou orientována ve stejném směru, CRE rekombináza zprostředkovává excizi nebo cirkularizaci segmentu. (B) pokud loxp místa lemují segment DNA v uspořádání cis a jsou orientována v opačných směrech, CRE rekombináza zprostředkovává inverzi segmentu. (C) pokud jsou loxP místa umístěna na různých řetězcích DNA a jsou orientována stejným směrem, CRE rekombináza zprostředkovává translokaci segmentu.
kmeny Cre a loxP se obvykle vyvíjejí nezávisle a poté se kříží. Mnoho různých Cre kmenů, každý obsahující Cre transgenu pod vedením různých tkání-specifický promotor, může být zkřížené s jedním loxP napětí. V závislosti na tom, které kmeny jsou připuštěny, různé Cre-zprostředkované model systémy mohou být konstruovány, včetně transgeniky, průchodky, hypomorphs, opravitelné hypomorphs, chromozom aberrants a strava-indukovaných mutantů. V podstatě, tím, míchání a odpovídající Cre a loxP kmenů, vyšetřovatel může studovat genové účinky v tkáni a vývojové fáze-konkrétní způsoby, které byly dříve nemožné.
systém FLP-FRT
systém FLP-FRT je podobný systému Cre-lox a stále častěji se používá v myším výzkumu. Zahrnuje použití rekombinázy flippase (FLP), odvozené z kvasinek Saccharomyces cerevisiae (Sadowski 1995). FLP rozpoznává pár sekvencí FLP rekombinázového cíle (FRT), které lemují genomickou oblast zájmu.
Araki K, Imaizumi T, Okuyama K, Oike Y, Yamamura k.1997. Účinnost rekombinace přechodnou expresí Cre v embryonálních kmenových buňkách: srovnání různých promotorů. Jaromír Jágr (Tokio) 122: 977-82.
Brocard J, Spadl R, Chambon P, Metzger D. 1998 chimérická Cre rekombinantní interferon indukovatelnou pomocí syntetické, ale ne přirozené ligandy pro glukokortikoidní receptor. Nukleové Kyseliny Res 26: 4086-90.
Jax poznámky. 1999. NIH, Jackson Laboratory a DuPont Pharmaceuticals podepisují dohody o použití technologie Cre-lox. JAX 476: 4.
Kellendonk C, Tronche F, Reichardt HM, Schutz G.1999. Mutageneze glukokortikoidního receptoru u myší. J Steroid Biochem Mol Biol 69: 253-9.
Nagy a.2000. Cre rekombináza: univerzální činidlo pro přizpůsobení genomu. Genesis 26: 99-109.
Sadowski P.1995. Flp rekombináza 2-µm plazmidu Saccharomyces cerevisiae. Prog Nukleová Kyselina Res Mol Biol 51: 53-91.
Sauer B, Henderson N.1988. Místně specifická rekombinace DNA v savčích buňkách Cre rekombinázou bakteriofága P1. Proc Natl Acad Sci Us A 85: 5166-70.
Sternberg N, Hamilton d.1981. Lokálně specifická rekombinace bakteriofága P1. I. rekombinace mezi loxp weby. J Mol Biol 150: 467-86.
Utomo AR, Nikitin AY, Lee WH. 1999. Časová, prostorová a buněčná typově specifická kontrola rekombinace DNA zprostředkovaná Cre u transgenních myší. Nat Biotechnol 17: 1091-6.