Cytopatického efektu (CPE): jak viry dostat pryč s vraždou

Viry, podle definice, jsou neviditelné pro naše oči. Jsou to nanostruktury, které se mohou zviditelnit pouze pomocí elektronové mikroskopie, což je technika, která je časově náročná a není přístupná všem. V důsledku toho musí virolog najít alternativy, aby mohl pracovat a studovat svůj předmět zájmu. Praktickým způsobem „vidění“ a nepřímého měření virové infekce je pohled na poškození, které virus způsobuje buňce. Toto utrpení nebo poškození je známý jako cytophatic efekt (CPE) a jeho měření je široce používán v oblasti virologie laboratoře po celém světě.

CPE je velmi základní přístup k pochopení toho, jak virus infikuje buňku, ale to neznamená, že se používá pouze v základním vědeckém výzkumu. Měření CPE může být také velmi užitečným odečtem pro farmaceutické společnosti a diagnostické laboratoře.

co je cytofatický účinek vyvolaný virem?

viry jsou paraziti, kteří potřebují hostitelskou buňku k replikaci. Jakmile jsou uvnitř buňky, unesou buněčné stroje a produkují vlastní proteiny, nukleovou kyselinu a membránu(v případě potřeby).

vzhledem k tomu, že virus zabírá buněčné faktory, které jsou jinak používány buňkou, může jeho replikace změnit základní funkce hostitelských buněk nebo dokonce zničit. Sada buněčných změn nebo změn vyplývajících z virové infekce je známá jako CPEs. Jedná se obvykle o negativní změny, které mohou způsobit strukturální, metabolické nebo funkční modifikace v infikované buňce. V průběhu času může CPE vyvolat patologické účinky viru (onemocnění).

klasické příklady cytopatického účinku

známým virem indukovaným CPE je buněčná smrt (podívejte se na video umírající buňky v ). Mnoho virů zabíjí buňky buď lýzou nebo indukcí apoptózy. Například HIV je známo, že zabíjí CD4+ T lymfocyty, což je hlavní důvod, proč se infikovaní jedinci stávají imunokompromitovanými.

v laboratoři je snadný způsob, jak zabít buněčnou linii komárů (jako je C6 / 36) nebo buňky Vero, infikováním jakýmkoli slavným arbovirem, jako je Chikungunya, Dengue nebo Zika. Po několika dnech infekce se buňky rozpadnou přímo před očima (obr. 1).

Obrázek 1 / Vero buňky byly infikovány virem Zika. Po 72 hodinách infekce je jasný CPE patrný přítomností buněčného debri v důsledku buněčné smrti.

dalším příkladem CPE je tvorba syncytia. Buňky infikované obalenými viry exprimují virové proteiny na své plazmatické membráně, které viry používají k zprostředkování fúze s hostitelskou buňkou. Když se tyto virové proteiny vážou na receptory na povrchu sousedních buněk, dochází k fúzi buněk a buněk, což vede k tvorbě syncytia (vícejaderná obří buňka).

respirační syncytiální virus (RSV) je hlavní příčinou virové pneumonie u malých dětí. Jeho název je odvozen od skutečnosti, že může tvořit syncytii v buněčné kultuře, ale pozoruhodně také v plicích infikovaných pacientů.

změny morfologie buněk související s CPE také zahrnují zaokrouhlení, oddělení a / nebo shlukování adherentních buněk. V tomto případě zůstávají infikované buňky metabolicky aktivní, aby replikovaly virus, ale jejich cytoskelet je změněn. Morfologické změny lze vysvětlit down-regulací exprese povrchových adhezních proteinů v důsledku infekce. Je například známo, že virus Ebola způsobuje dramatické morfologické změny v adherentních buňkách snížením exprese integrinu β1.

opravdu potřebujete tolik dramatu (smrt, gigantismus, deformace), aby bylo považováno za CPE? Č. Buňky se mohou při infekci“ chovat “ jinak, ale vypadají stejně. Jemnější, ale stále jasné změny typu CPE mohou zahrnovat změnu rychlosti růstu / kinetiky, změny v dané metabolické aktivitě nebo změny funkce buněk. Mezi různými viry, které mohou indukovat tyto typy CPEs, stojí virus Zika. V roce 2015 byl tento virus přenášený komáry všude ve zprávách, protože způsobuje mikrocefalii, závažné neurologické poškození charakterizované sníženou velikostí mozku u plodů. Později bylo popsáno, že mikrocefalie je výsledkem několika Zika-indukovaný cytopatický účinek na nervové buňky, včetně buněk hypertrofie, omezení růstu, buněčného cyklu dysregulace, a buněčné smrti. Byl použit test tvorby kolonií, například, určit, který z různých proteinů Zika interferuje s buněčnou proliferací.

pro výzkumníky, kteří systematicky porovnávají kinetiku růstu buněčných linií, doporučujeme CytoSMART Omni. Kinetické zobrazování živých buněk celých jamek pomocí automatizovaného softwaru pro skenování a šití obrázků. Obraz plný dobře desky pro hodiny až týdny najednou.

Cytopatické účinky jsou výsledkem interakcí virus-hostitel

je důležité zmínit, že CPE není definován pouze virem, ale také hostitelskou buňkou. Záleží na tom, jak tolerantní jsou buňky k infekci. Být tolerantní buňkou, která může podporovat růst viru. Jinými slovy, ne všechny viry mohou infikovat všechny typy buněk. , Aby to jednoduché, můžeme říci, že:

• Není permisivní buňka – Virus nemůže nakazit
• Permisivní buňka – Virus může replikovat, ale nezpůsobuje zjevné CPE
• Vysoce tolerantní buňky – Virus replikuje a navozuje zřejmé CPE

pokud jste virus přidat do vašich buněk a nic se neděje, nebojte se. Stačí najít správnou kombinaci viru a buněk.

odečty-jak měřit CPE?

virové buněčné změny, jako je buněčná smrt nebo změněná morfologie, jsou viditelné světelnou mikroskopií. Stačí dát talíř pod standardní obrácený mikroskop a zjistit, zda vaše buňky zemřely nebo se nějak změnily. Pozitivním aspektem tohoto přístupu je, že je „snadný“, protože nevyžaduje žádné zpracování vzorku, což zabraňuje fixaci nebo barvení artefaktů.

na druhou stranu je kvalitativní a ne kvantitativní a silně se spoléhá na výcvik pozorovatele. V současné době lze tento přístup automatizovat sledováním cytopatogeneze vyvolané virem v reálném čase. Například změny viru šíření a proliferace buněk lze posoudit pomocí testu hojení ran, kde může být detekována snížená rychlost migrace kolektivních a jednobuněčných buněk spolu se závažnými změnami morfologie buněk. Dalším kvantitativním přístupem je monitorování buněčné proliferace automatizovanou analýzou obrazu. Pomocí této technologie je možné generovat růstové křivky infikovaných vs. neinfikované buněčné kultury pro správnou kvantifikaci cytopatického účinku, který může mít virová infekce.

Pokud jsou buňky smrti tím, co dělá váš den, alternativou je slavný test plaku. Tato klasická virologická technika se používá ke kvantifikaci infekčních virových částic a je založena na principu, že viry mohou vyvolat buněčnou lýzu. Po infikování monovrstva vysoce tolerantní buňky, jsou buňky s kontrastním crystal violet (živé buňky jsou obarveny, smrt buňky zůstávají neobarvené), což v krásné plakety (oblastí smrt buněk), které lze snadno vyčíslit pouhým okem.

ale nemusíte vidět své buňky, abyste věděli, že jsou smrt. Životaschopnost buněk po infekci lze měřit kvantifikací intracelulární koncentrace ATP pomocí světlušky luciferázy nebo tradičním MTT testem.

práce s viry může být hádka, BSL-3/4 laboratoře mají přísná bezpečnostní opatření a dostat se do a z laboratoře trvá hodně času. Pro vědce, kteří hledají řešení pro sledování svých buněk, aniž by museli vstoupit do laboratoře, doporučujeme podívat se na CytoSMART Lux2 Duo Kit.

aplikace

vyvolává váš virus CPE? Můžete to jasně vidět nebo měřit? Skvělé! Tento CPE můžete použít jako odečet úspěšné virové infekce nebo replikace. Dané CPE může sloužit jako indikátor zjistit, jak, aby se zabránilo infekci, charakterizovat hostitele nebo patogenu faktory nutné pro infekci, identifikovat virus tropismu, mezi ostatními. Z praktického hlediska to znamená, že může být použit jako odečet pro:

• Screening a hodnocení antivirové sloučeniny
  může kandidát na léčivo zabránit tvorbě CPE?
• Screening neutralizačních protilátek
  může daná protilátka inhibovat virus indukovaný CPE?
• Dohled nad antivirové rezistence (fenotypizaci)
  Může daný izolát viru vyvolat CPE v přítomnosti antivirotika?
• charakterizace virového tropismu
  které typy buněk jsou přednostně infikovány virem? Proč? (Podívejte se na nedávnou publikaci s nechvalně známým SARS-CoV-2 v .)
• diagnostika virových onemocnění
  je virus aktivně infikující osobu? Je klinický vzorek odebrán od této osoby vyvolávající CPE? Mějte na paměti, že většina diagnostických metod (ELISA, RT-qPCR) nezjistí infekční virové částice.

Na závěr …

ačkoli existuje několik způsobů měření virové infekce, kontrola CPEs v permisivních buňkách zůstává jako široce používaná alternativa. Aby to bylo opravdu užitečné, musíte najít správnou kombinaci: virus, tolerantní buňku a přesný údaj. Jakmile najdete tuto kombinaci, aplikace mohou být velmi rozmanité a užitečné buď v akademickém prostředí, v průmyslu nebo v klinické diagnostice.

informace o všech zobrazovacích řešeních CytoSMART naleznete zde