shRNA proti siRNA
RNA interference (RNAi) je biologický proces, kdy molekuly RNA se používají k inhibici genové exprese. Obvykle se vytvářejí krátké molekuly RNA, které jsou komplementární k endogenní mRNA a po zavedení do buněk se vážou na cílovou mRNA. Vazba krátké molekuly RNA na cílovou mRNA funkčně inaktivuje cílovou mRNA a někdy vede k degradaci cílové mRNA.
historicky byly v aplikacích RNAi použity dva typy krátkých molekul RNA. Malá interferující RNA (siRNA) jsou typicky dvouvláknové molekuly RNA o délce 20-25 nukleotidů. Při transfekci do buněk siRNA přechodně inhibuje cílovou mRNA, dokud nejsou také degradovány v buňce. Malé vlásenky RNA (shRNA) jsou sekvence RNA, obvykle asi 80 párů bází na délku, které zahrnují oblast vnitřní hybridizace, která vytváří strukturu vlásenky. molekuly shRNA jsou zpracovány v buňce za vzniku siRNA, která zase srazí genovou expresi. Výhodou shRNA je, že mohou být začleněny do plazmidových vektorů a integrovány do genomové DNA pro dlouhodobější nebo stabilní expresi, a tím i delší knockdown cílové mRNA.
shRNA je zpracován v buňce tím, že Exportin 5, Dicer, a RISC/AGO2 komplexu. Lentivirová dodávka shRNA umožňuje stabilní expresi a trvalé vyřazení cílového genu. (Obrázek Dan Cojocari ✉ · ✍ · [CC BY-SA 3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0) nebo GFDL http://www.gnu.org/copyleft/fdl.html, via Wikimedia Commons)
Efektivní Vyjádření shRNAs Od RNA Polymeráza III Pořadatelé
Malých Rna včetně shRNAs jsou přepisována endogenně s RNA Polymerázy III (Pol III). Toto je odlišné od cDNAs, které jsou transkribovány pomocí RNA polymerázy II. Proto, aby byla zaručena vysoká exprese shRNAs, Cellecta použití stimulátorů, které se specificky vážou Pol III, U6 a H1 organizací. Jak U6 a H1 promotéři fungují dobře vyjádřit vysoké úrovně shRNAacross mnoho typů buněk, ve srovnání s Pol II promotory, jako jsou CMV a EF1, která nevyjadřují shRNAs, jak efektivně vzhledem k jejich malé velikosti. Kromě toho promotory pol II používané pro expresi shmir nemusí fungovat ve většině typů buněk, kde U6 a H1 fungují dobře.
Lentiviral Vektory Umožňují Trvalé Vyřazující z Cílů
shRNA stává stabilně integrován do genomu hostitelské buňky. Jak se buňky dělí, shRNA se přenáší na dceřiné buňky. Použití lentivirových vektorů pro expresi shRNAs poskytuje trvalé knockdown bez nutnosti transfektovat buňky vícekrát. Zjistit více o tom, jak lentiviral vektorů práce, viz náš lentiviral vektor stránka systému.
optimalizace návrhu shRNA
navrhování účinných shrna je nezbytné pro efektivní screening RNAi knockdown. Kromě výběru optimální sekvence existuje řada strukturálních faktorů, které ovlivňují účinnost shRNA. Kromě toho struktura vlásenky shRNA s kmenovou smyčkou představuje problémy pro konstrukci a zesílení knihovny. Pro vytvoření reprezentativních kvalitních knihoven shRNA jsme zaměřili značné úsilí na optimalizaci efektivity vložek shRNA v našich knihovnách. Vyvinuli jsme vlastní algoritmus pro předpovídání nejúčinnějších sekvencí shRNA, a kombinovat to s publikovanými daty ověřených sekvencí při konstrukci našich knihoven. Optimalizovali jsme také strukturu shRNA pro výstavbu knihoven.
, Aby efektivně testovat shRNA strukturu variace na velkém měřítku, jsme vyvinuli high-propustnost shRNA zkoušení účinnosti technologie na základě reporter assay. To bylo již dříve prokázáno, že reportér genu (jako ONZP) s 3′ syntézy cDNA fragment nebo krátký oligonukleotid z cílového genu by mohly být efektivně využity k monitorování účinnosti siRNA a shRNA konstrukce proti této cílového genu. Na základě těchto zjištění jsme vyvinuli lentivirový reportérový vektor pro identifikaci funkčních konstrukcí shRNA (Obrázek 1). Naše proprietární shRNA testování reportér vektor umožňuje klonování obou shRNA šablony proudění H1 promotor a cílové sekvence na 3′ konci GFP reportér. Když tento konstrukt je transduced do buněk, přepis z H1 promotor produkuje shRNA, zatímco přepis z CMV promotoru generuje ONZP-smysl cílové mRNA fúzního transkriptu, který může být použit jako reportér pro screening funkční shRNAs.
Mapa shRNA-cíl lentiviral reportér postavit integrované v genomické DNA a mechanismus příklepu ONZP-cíl reportér. Buňky transdukované funkčními konstrukcemi shRNA budou mít nízké hladiny mRNA GFP, zatímco nefunkční shrna umožňují vysokou úroveň exprese mRNA GFP.
optimalizovat strukturu shRNA, zkonstruovali jsme za shRNA-cíl knihovna v shRNA ověření vektor pro 150 shRNAs, s každou shRNA postavena ve 40 různých provedeních popsaných v literatuře.
provedli Jsme RNAi obrazovkách v CHO-TRex buňky transduced s tímto 150×40 bar-kódované shRNA-Cíl knihovna a měří zastoupení (v knihovně a transduced buňky) a poražený účinnosti jednotlivých shRNA postavit. Některé reprezentativní údaje z tohoto screeningu jsou uvedeny níže.
deset nejlepších návrhů byly vybrány na základě těch, které mají nejvyšší cíl povalení činnost, stejné zesílení účinnosti stejného designu sdružených oligonukleotidy, a rovné zastoupení stejného designu shRNAs v souhrnné RNAi knihovny. Vyřazující účinnosti tři p53 shRNAs konstruovány s těchto 10 nejlepších návrhů v lentiviral vektor byl dále analyzovány pomocí RT-PCR po transdukci do myších fibroblastů buněk.