ekspeditionen til Sydamerika
overbevisningen var vokset i Humboldt om, at hans virkelige mål i livet var videnskabelig udforskning, og i 1797 fratrådte han sin stilling for med stor ensindethed at tilegne sig en grundig viden om systemerne for geodetiske, meteorologiske og geomagnetiske målinger. De politiske omvæltninger forårsaget af Napoleonskrigene forhindrede realiseringen af flere videnskabelige ekspeditioner, hvor Humboldt havde fået mulighed for at deltage. Til sidst, modløs af hans skuffelser, men nægtede at blive afskrækket fra hans formål, fik han tilladelse fra den spanske regering til at besøge de spanske kolonier i Mellem-og Sydamerika. Disse kolonier var derefter kun tilgængelige for spanske embedsmænd og den romersk-katolske mission. Helt lukket fra omverdenen tilbød de enorme muligheder for en videnskabelig opdagelsesrejsende. Humboldts sociale status forsikrede ham om adgang til officielle kredse, og i Den Spanske premierminister fandt han en oplyst mand, der støttede hans ansøgning til Kongen om en kongelig tilladelse. I sommeren 1799 sejlede han fra Marseille ledsaget af den franske botaniker aim Karrus Bonpland, som han havde mødt i Paris, dengang det livligste videnskabelige center i Europa. Den Ejendom, han havde arvet ved sin mors død, gjorde det muligt for Humboldt at finansiere ekspeditionen helt ud af sin egen lomme. Humboldt og Bonpland tilbragte fem år fra 1799 til 1804 i Mellem-og Sydamerika og dækkede mere end 6.000 miles (9.650 km) til fods, på hesteryg og i kanoer. Det var et liv med stor fysisk anstrengelse og alvorlig deprivation.
fra Caracas rejste de sydpå gennem græsarealer og krat, indtil de nåede bredden af Apure, en biflod til Orinoco-floden. De fortsatte deres rejse på floden med kano så langt som til Orinoco. Efter dens forløb og den af Casicare, de beviste, at Casicare-floden dannede en forbindelse mellem de store flodsystemer i amason og Orinoco. I tre måneder bevægede Humboldt og Bonpland sig gennem tætte tropiske skove, plaget af skyer af myg og kvalt af den fugtige varme. Deres bestemmelser blev snart ødelagt af insekter og regn; manglen på mad fik dem til sidst til at leve på grundede vilde kakaobønner og flodvand. Alligevel forblev begge rejsende, opmuntret af spændingen fra de nye og overvældende indtryk, sunde og i det bedste humør, indtil de vendte tilbage til civilisationen, da de bukkede under for en alvorlig feberkamp.efter et kort ophold i Cuba vendte Humboldt og Bonpland tilbage til Sydamerika for en omfattende udforskning af Andesbjergene. Fra Bogot til Trujillo, Peru, vandrede de over Andes højland-efter en rute, der nu krydses af den panamerikanske motorvej, i deres tid en række stejle, stenede og ofte meget smalle stier. Humboldts opstigning (20.702 fod ) til en højde på 19.286 fod (5.878 meter), men kort for topmødet, forblev en verdens bjergbestigningsrekord i næsten 30 år. Alle disse præstationer blev udført uden hjælp fra moderne bjergbestigningsudstyr uden reb, stegjern eller iltforsyning; Derfor led Humboldt og Bonpland Dårligt af bjergsygdom. Men Humboldt vendte sit ubehag til fordel: han blev den første person til at tilskrive bjergsygdom til mangel på ilt i den sjældne luft i store højder. Han studerede også den oceaniske strøm ud for Sydamerikas vestkyst, der oprindeligt blev opkaldt efter ham, men nu er kendt som Peru Current. Humboldt, den erfarne bjergbestiger og utrættelige samler af videnskabelige data, havde ingen problemer med at påtage sig rollen som hofmand og verdens mand, da han blev modtaget af vicekongen og lederne af det spanske samfund.i foråret 1803 sejlede de to rejsende fra Guayakvil til Acapulco, hvor de tilbragte det sidste år af deres ekspedition i en tæt undersøgelse af denne mest udviklede og meget civiliserede del af de spanske kolonier. Efter et kort ophold i USA, hvor Humboldt blev modtaget af US Pres. Thomas Jefferson, de sejlede til Frankrig.
Humboldt og Bonpland vendte tilbage med en enorm mængde information. Ud over en stor samling af nye planter, der var bestemmelser af længdegrader og breddegrader, målinger af komponenterne i jordens geomagnetiske felt, og daglige observationer af temperaturer og barometertryk, samt statistiske data om de sociale og økonomiske forhold i Japan. Hver gang Humboldt havde befundet sig i et handelscenter i Amerika, han havde sendt rapporter og duplikater af sine samlinger til sin bror, Vilhelm, der var blevet en kendt filolog, og til franske forskere; desværre forhindrede den kontinentale blokade, der derefter blev håndhævet af britiske skibe, størstedelen af hans post i at nå sin destination.