fem Pek-6 varianter og deres ekspressionsmønstre i blæksprutteembryoner og voksne øjenvæv
Vi udførte en enkelt 3′-RACE PCR til pygmy blæksprutte-6 genet (betegnet som Ippaks-6) for at undersøge splejsningsvarianterne og flere loci af Pek-6 i coleoid blæksprutter. Vi fandt ud af, at der ikke var flere loci i pygmy blæksprutte, men vi identificerede tre Paks-6 varianter af diskrete længder. Forskelle i aminosyresekvenserne blandt disse Paks-6-varianter var begrænset til begrænsede regioner. Derfor blev de antaget at være resultatet af alternative splejsningshændelser på et enkelt sted. Vi validerede derefter tilstedeværelsen af splejsningsvarianter ved hjælp af RT-PCR, og vi opnåede endelig fem typer splejsningsvarianter, herunder en tilsyneladende ortolog af autentisk Pak-6 (figur 1). Længden og strukturen af autentiske Ippaks-6 svarede til dem af de Paks-6 gener, der findes i andre blæksprutte arter,Euprymna scolopes og Loligo pealei15, 16. Autentisk ippaks-6 (autentisk form, 499 aa) omfatter to uafhængige DNA-bindende domæner, PD-og HD-domænerne og et C-terminal P/S/T-rigt domæne (PST), som er den dedikerede aktivator med et partnertransaktivatorprotein, som vist hos mange dyr (figur 1). Både proteinsekvenslighed og fylogenetisk træ bekræftede, at Ippaks-6 var en ortolog af flyve ey og hvirveldyr-4/6 (supplerende figur 1). De fire identificerede varianter producerede proteiner med længder, der adskiller sig fra den autentiske Ippaks-6 (figur 1).
diagrammer af splejsningsvarianter fundet i pygmy blæksprutte.
den øverste række viser en estimeret ekson-intronstruktur af blæksprutte-6-genet. Pilespidsen viser en intron bekræftet i blækspruttearter ved genomisk PCR-analyse og i en tidligere undersøgelse. Den autentiske form (499 aa) er den mest rigelige og ligner Paks-6-genet fra andre blækspruttearter. Varianter 1 og 3 mangler ekson 4-Koder for den N-terminale halvdel af HD. Varianter 2 og 3 har en ekstra ekson, ekson 6, i PST-domænet. Variant 4 viser også en yderligere ekson 3, der koder for 20 aminosyrer i linker-regionen mellem PD-og HD-domænerne.
for at undersøge den scenespecifikke ekspression af blæksprutte-6-varianterne udførte vi K-PCR for forskellige væv og på forskellige embryonale stadier ved hjælp af primere designet til at målrette de yderligere eksoner af Ippaks-6 (figur 2 & figur S2). Blæksprutteæg viser epibolisk gastrulation og direkte udvikling uden typiske bløddyrs larvestadier17. Embryonale øjne vises fra den ydre epiderm af blastodisc og kan differentieres efter trin 18, hvor retinal pigmentering starter ved trin 20. Linsen fremstår som en gennemsigtig pindlignende struktur, der er synlig for det blotte øje på trin 25. Vi udførte først PCR ved hjælp af primere rettet mod ekson 2, der dækker alle fem varianter. PCR-analysen viste, at Ippaks-6 blev udtrykt i trin 16 før dannelse af vesikler i øjet (figur 2a). Ekspressionsintensiteten af Ippaks-6 blev gradvist opreguleret med udviklingen af blæksprutteembryoet (figur 2a), hvor øjeæblet viste de højeste ekspressionsintensiteter blandt de testede væv. Som observeret hos de andre bilaterale dyr blev de autentiske og variantformer af Ippaks-6 udtrykt ved markant deprimerede niveauer i muskelvævet. Vi brugte derefter primere rettet mod varianter, der manglede ekson 4 (varianter 1 og 3, figur 2b). Primerne detekterede varianter 1 og 3 ved lave niveauer i embryonerne på trin 16 og i øjenæblevævet. Vi brugte også primere rettet mod varianter, herunder ekson 6 (varianter 2 og 3, figur 2C). PCR – analysen viste, at varianter 2 og 3 blev udtrykt i øjenkugler og optiske lapper såvel som i embryoner i trin 16 og 25. Da dannelsen af fotoreceptorceller og linsen begynder i embryoner i trin 25, kan varianterne inklusive ekson 6 bidrage til øjenudvikling. Resultaterne viser, at ekspressionsmønstrene for ippaks-6-varianterne adskiller sig væsentligt fra den autentiske ippaks-6.
ekspression af pygmy blæksprutte-6 varianter.
ekspressionsniveauer for alle ippaks6-varianter (a), varianter uden ekson 4 (varianter 1 og 3) (B) og varianter inklusive ekson 6 (varianter 2 og 3) (C) blev kvantificeret ved realtids RT-PCR-analyse. Ekspressionsniveauet i hver kropsdel i forhold til trin16 (1.0) blev beregnet og efterfølgende normaliseret til ekspressionsniveauet for Alfa-tubulin. Kvantificeringerne blev udført to gange på forskellige cDNA ‘ er genereret uafhængigt, og geometriske midler blev beregnet. Y-aksen er vilkårlig. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelser. (D–G) helmonterede in situ-hybridiseringsanalyser med anti-sense RNA-prober til Ippaks-6 ekson 2 (D, F) og Ippaks-6 ekson 4 (E, G). En RNA-probe designet fra ekson 2 rettet mod alle fem varianter viste Paks-6 ekspression på tværs af hjerneområdet af embryoner i trin 22 (D) og i trin 25 (F). RNA-sonden designet fra ekson 2 indikerer også Pak – 6-ekspression omkring øjnene (D’, set fra siden). En RNA-probe designet ud fra ekson 4-målretningsvarianter iboende såvel som variantformer 2 og 4 viste lignende ekspressionsmønstre (E, G) som den for sonden, der målretter mod ekson 2, undtagen i vævet omkring øjnene (E). Dette resultat antyder, at varianterne med en ekson 4-sletning (varianter 1 og 3) viser specifik lokalisering i vævet omkring øjnene sammenlignet med de andre varianter (pilespids). Skalestænger, 10 liter.
for at skelne mellem hvilke varianter der er til stede i hvert trin, udførte vi RT-PCR ved hjælp af primersæt på tværs af eksongrænser. Variant 1 blev anset for at være udtrykt i alle/nogle embryonale stadier, men ikke i de voksne øjne (supplerende figur 2). RT-PCR-analyse viste også, at variant 4 var stærkt udtrykt i de voksne øjne, især i nethinden, men ikke i linserne (supplerende figur 2a). Varianter 2 og 3 blev udtrykt på tværs af alle embryonale stadier og også i voksne væv (supplerende figur 2b).
for at identificere den vævsspecifikke ekspression af ippaks-6-varianter udførte vi In situ–hybridisering ved hjælp af RNA-prober designet til at binde specifikt til hver variant (figur 2D-G). RNA-sonden designet fra ekson 2 er rettet mod alle fem varianter identificeret i denne undersøgelse. RNA-sonden er designet fra ekson 4 bundet til den autentiske form og til varianter 2 og 4. Ippaks – 6 viste sig at være lokaliseret i hjerneområdet, herunder den dorsale basale lob, overlegen frontal lobe, peduncle/olfaktoriske lobes og optiske lobes (figur 2D–G), som beskrevet i Hartmann et al.18 vævet uden for nethinden (måske svarende til det fremtidige iridoforlag) udtrykte også tydeligt Ippaks-6 i trin 22 (figur 2D og 2D’). Ippaks-6 ekspression blev observeret i dette lag indtil trin 25. In situ-hybridiseringen ved hjælp af sonden rettet mod ekson 4 antydede, at varianter 2 og 4 havde lignende ekspressionsmønstre i hjernen, men ikke i øjnene (figur 2e). Dette fund antyder, at varianter 1 og 3 (mangler ekson 4) opreguleres i det ydre lag af øjnene. Disse konsekvenser indebærer, at hver ippaks-6-variant reguleres uafhængigt på tværs af processerne for øjendannelse.
Ekson-intron struktur af Pak-6 i andre blæksprutter/bløddyr
Vi undersøgte, om denne type alternativ splejsning kun blev erhvervet i coleoid blæksprutter. Anvendelse af RT-PCR-analyse på japansk spydblæksprutte (Loligo bleekeri) embryonale RNA ‘er, vi fandt tre typer mRNA’ er, der muligvis stammer fra alternativ splejsning (ekson 4 Spring, ekson 3 indsættelse og ekson 6 indsættelse) i øjnene (figur 3a, B). De indsatte eksoner 3 og 6 kodede henholdsvis 20 og 40 aminosyrer, hvorimod de springede eksoner 4 kodede 51 aminosyrer. For at undersøge tilstedeværelsen af lignende alternativ splejsning i andre bløddyrsgenomer undersøgte vi ekson-intronstrukturerne af Paks-6 i uglen limpet og perle østers. Den komplette genomsekvens af uglen limpet (Lottia gigantea, opnået fra JGI genome portal Lotgi v1.0, E_gv1.86.103.1)19 og af pearl oyster (Pinctada fucata, opnået fra Oist Marine Genomics Unit genome bro.ser P. fucata_ver1.0, transkript: pfu_aug1.0_8418.1_67856.t1, stillads8418.1) 20 viste, at molluskan-6 har fem eksoner. Ekson 4 i blæksprutten blev konserveret på tværs af de testede bløddyrsarter. Eksoner 3 og 5 blev imidlertid ikke fundet i pearl oyster-6-genet. Således fandt vi, at variantformer 2 og 4 er erhvervet i coleoid blæksprutte afstamning (Figur 1).
Indels fundet i ippaks-6 varianter og forudsagte 3D strukturer af HD.
justerede nukleotidsekvenser af henholdsvis (a) ekson 3 og (B) ekson 6 af pygmy blæksprutte og den japanske spydblæksprutte. Justering af oversatte aminosyresekvenser af HD anvendt i sammenlignende modellering (C). Varianter 1 og 3 af Ippaks-6 mangler en del af spiral 1. Den tredimensionelle struktur af splejset HD opnået ved homologi modellering (D, D’). Grønne pinde indikerer proteiner af Ippaks-6, og grå kugler repræsenterer mål-DNA-molekyler. Den stiplede cirkel angiver den del af spiral 1, der er tabt ved sletning af ekson 4.
så vidt vi ved, er vores undersøgelse den første til at rapportere splejsningsvarianter af blæksprutte-6, der blev udtrykt forskelligt i henhold til det embryonale stadium. Tidligere undersøgelser isolerede diskrete typer splejsningsvarianter,der havde mistet den N-terminale halvdel af PD-domænet i andre blækspruttearter15, 18, men disse varianter viste ikke spatio-temporale forskelle i udtryk. Vores undersøgelse antydede også, at de mekanismer, der ligger til grund for erhvervelsen af variationer i Paks-6-udskrifter ved alternativ splejsning, er blevet entydigt erhvervet i coleoid blæksprutte afstamning, da de nedre bløddyr, såsom toskallede, ikke besidder et tilsvarende eksonlignende fragment i deres genomer.
funktion af blæksprutte-6-varianter og deres formodede rolle i øjenudvikling
tilsætning og sletning af et aminosyrefragment kodet i de alternativt anvendte eksoner forventes at forårsage strukturelle ændringer i ippaks-6-proteinvarianterne, hvilket kan ændre deres funktion i udviklingsprocessen. To af dens varianter (varianter 1 og 3) mangler en 153mer midt i autentisk Pak-6 og halvdelen af HD (Figur 1). For at undersøge, om sletningen påvirker deres funktionelle egenskaber, udførte vi tredimensionelle (3D) strukturelle forudsigelser af proteinerne baseret på sammenlignende modellering. De formodede 3D-strukturer i HD ‘ erne i autentisk Ippaks-6 og varianten, der manglede segmentet kodet af ekson 3, blev konstrueret. Skabelonstrukturen blev identificeret ved DNA-bundet form, så vi kunne forudsige strukturen af Ippaks-6 og varianten i DNA-bundet form. Den formodede 3D-struktur af den autentiske form var rimeligt godt modelleret; kerneresterne, nemlig Phe på sløjfen før den første spiral af HD, Leu på den første spiral, Leu på den anden spiral og Trp og Phe på den tredje spiral af modelstrukturen, blev bevaret, og de tre spiraler af HD var tilsyneladende tæt pakket ind i hinanden (figur 3c). De rester, der var vigtige for DNA-binding, nemlig to Arg-rester ved den N-terminale arm og polære rester på overfladen af den tredje spiral, var placeret rimeligt tæt på DNA-grænsefladen (figur 3c, D). Den formodede 3D-struktur af varianten præsenterede imidlertid en række problematiske problemer. I den modellerede struktur blev tabet af regionen kodet af ekson 3, som koder for den N-terminale del af den første spiral, kompenseret med 15 rester kodet i ekson 2. Aminosyresekvenserne af de autentiske og variantformer adskilte sig således kun i det område, der indeholdt de 15 rester af den N-terminale side. Denne forskel øgede imidlertid variantens strukturelle energi betydeligt og destabiliserede tilsyneladende den samlede struktur. Denne ustabilitet kan skyldes mangel på Phe på sløjfen før den første spiral og af Leu på den første spiral. Disse komponenter er åbenbart vigtige for pakning af de tre spiraler. Derudover manglede to Arg-rester ved den N-terminale sløjfe, der binder til DNA-baserne i den mindre rille i den autentiske form i varianten. Disse problemer med stabilitet og DNA-binding i varianten tyder stærkt på, at variantens HD er ustabil, og at domænet har ringe bindingsaffinitet for DNA (figur 3D og 3D’). Manglen på en stabil HS antyder yderligere, at varianter 1 og 3 har forskellige DNA-målsteder end autentiske ippaks-6 i blækspruttearter.
to varianter (varianter 2 og 3) udviste også en 120 mer indsættelse inden for PST-domænet (Figur 1). Den indsatte sekvens viste sig at være specifik for blæksprutte (figur 2). Denne indsættelse kan ændre transaktiveringsaktiviteterne i PST-domænet. Variant 4 viste en unik indsættelse (57 mer) mellem PD og HD. Motivprogrammet (http://www.genome.jp/tools/motif/) fandt ingen kendte domæner eller signaturer i den indsatte sekvens. Denne indsættelse forlænger en linker mellem PD-og HD-domænerne.