HPV/p16-positive og negative HNSCC viser forskelle i nodal involvering
vi bestemte HPV-og p16-status for 241 oropharyngeal pladecellecarcinom (OPC) patienter behandlet med (kemo)stråling (C)RT. De humane tumorprøver blev erhvervet i henhold til protokoller godkendt af Etisk bestyrelse for Universitetshospitalerne Leuven (Leuven, Belgien) og underforstået samtykke fra alle patienter blev opnået. Klinikopatologiske data blev ekstraheret fra patientdiagrammer, og den gennemsnitlige opfølgningstid var 4,19 år. HPV-positive patienter blev karakteriseret ved lavere t-stadier med 45% (26 ud af 58; p = 0, 025) af HPV-positive patienter, der viste tumorer i T1/2-stadiet, mens dette var 29% (51 ud af 175; p = 0, 025) i HPV-negativ gruppe. Desuden viste HPV-positive tumorer signifikant højere (p = 0.014) nodal involvering med 72% (42 ud af 58) af HPV-positive patienter, der viste N2/N3-tumorer, mens dette kun var 54% (95 ud af 175) i HPV-negativ gruppe. Selvom forholdet mellem p16-status og N-fase ikke var signifikant, blev der set en tendens til højere knudeinddragelse og P16-positivitet. Treogtres% af p16-positive patienter viste N2 / N3-tumorer, mens dette kun var 54% i den P16-negative gruppe (tabel 1). Disse resultater er i overensstemmelse med andre undersøgelser, der viser, at HPV-positive hnscc-patienter har højere n-og lavere T-stadier .
som forventet resulterede lave T-stadier i bedre fjernkontrol (DC) med 5-årige kontrolhastigheder på 83% og 70% (p = 0,04) for T1 / T2 og T3 / 4 tumorer henholdsvis (yderligere fil 1: figur S1A). N2/3 tumorer (5-årig DC 70%; p = 0,02) viste en højere risiko for fjern fiasko sammenlignet med N0 / 1 tumorer (5-årig DC-hastighed 85%; p = 0,02) (yderligere fil 1: Figur S1B). Der blev ikke set nogen statistisk signifikant forskel i JÆVNSTRØMSRATE mellem HPV-positiv og negativ sygdom (5-årig JÆVNSTRØMSRATE på 82% versus 5-årig JÆVNSTRØMSRATE på henholdsvis 72%; p = 0,20) (yderligere fil 1: Figur S1C). Selvom det ikke er signifikant, antyder denne 10% forskel i DC-hastigheder indflydelse af virussen ud over lokal tumorkontrol. Desuden indikerer det tilstedeværelsen af forskellige formidlingsmønstre mellem HPV-positiv og negativ HNSCC.
p16 undertrykker invasionen og migrationskapaciteten af HPV-positiv HNSCC
for at undersøge den molekylære mekanisme bag disse potentielle forskelle set i metastase i vores patientkohorte vurderede vi In vitro migration og invasionskapacitet af hnscc-celler. HPV / p16-positive scc154-og SCC104-celler viste en signifikant lavere migrationsrate sammenlignet med HPV/p16-negative KVD9 -, CAL27-og SC263-celler (Fig. 1a). I overensstemmelse med migrationsanalysen viste HPV/p16-positive celler reducerede invasionsevner sammenlignet med HPV/p16-negative celler (Fig. 1b).
p16 represses the in vitro invasion and migration capacity of HPV positive HNSCC. a Migration capacity of HPV negative cells (SQD9, CAL27 and SC263) and HPV positive cells (SCC154, SCC104). b Invasion capacity of HPV negative SQD9 cells and HPV positive SCC154 cells. c Migration capacity of HPV positive SCC154 cells treated with shRNA for p16 (shp16) and control (shluc). D Invasionskapacitet af HPV-positive scc154-celler behandlet med shRNA for p16 (shp16) og kontrol (shluc). (a-d) resultatet er vist som middelkurs for tre eksperimenter, og p-værdier beregnes ved tosidet t-test
tumorundertrykkeren p16 er en velkendt cellecyklusregulator og en god surrogatmarkør for HPV-positiv HNSCC . Desuden tilskriver nylige data en bredere rolle for p16, herunder en rolle i migration og undertrykkelse af angiogenese . Derfor undersøgte vi også indflydelsen af p16 på migration og invasionskapacitet af HPV-positive scc154-celler manipuleret med kort hårnål RNA (shRNA) til p16 (shp16) og kontrol shRNA (shluc). Nedregulering af P16-ekspression øgede migrations-og invasionskapaciteten for scc154-cellerne (Fig. 1c og d). Disse data verificerer tilstedeværelsen af forskelle i formidlingsmønstre mellem HPV-positiv og negativ HNSCC og antyder en aktiv rolle af p16 i den metastatiske kaskade.
p16 undertrykker migration og invasion gennem angiogenese i HPV-positiv HNSCC
det er velkendt, at angiogenese, som aktivt opretholdes i kræftceller af pro-angiogene faktorer, såsom vaskulær endotelvækstfaktor a (VEGFA), er en kanal til kræftcellespredning og metastase og fremmer aggressiv tumorprogression . Desuden er den negative korrelation mellem HPV/p16 og VEGFA tidligere beskrevet i hnscc . Derfor vurderede vi forholdet mellem HPV, p16 og VEGFA i vores patientkohorte. HPV-positive patienter viste signifikant lavere VEGFA-ekspression, hvor 54% (28 ud af 51) af patienterne viste ingen eller lav VEGFA-ekspression sammenlignet med 32% (53 ud af 161) i HPV-negativ gruppe (tabel 2). Selvom den negative korrelation mellem VEGFA og p16 var mindre udtalt, sås en tendens til signifikans (tabel 2).
Vi undersøgte yderligere forholdet mellem angiogenese og p16 med in vivo-røntgenbilleder injiceret med SCC154 HPV-positive celler manipuleret med shp16 eller shluc. Et højere antal blodkar blev påvist i musetumorer med lav P16-ekspression sammenlignet med kontroltumorer (Fig. 2a). Desuden resulterede stigningen i vaskularisering i lavere nekrose, højere antal mitotiske celler og vækstfordel ved shp16, der udtrykker tumorer (yderligere fil 2: Figur S2A-C). Vi kunne ikke verificere involveringen af p16 i undertrykkelse af metastase in vivo på grund af fraværet af en metastatisk dyremodel. Vækstfordelen og den øgede vaskularisering set i shp16-musetumorer kan imidlertid forklare den hyppige forekomst af avancerede t-stadier hos HPV-negative hnscc-patienter.
Dual rolle p16 i formidling af HNSCC. en Blodkardannelse i scc154 shp16 og scc154 shluc-musemodeller vurderet ved CD31-farvning (over grafen); n = 5. B gennemsnitligt antal lymfekardannelse i scc154 shp16 og scc154 shluc-musemodeller vurderet ved LYVE – 1-farvning (over grafen); n = 5. c gennemsnitlig score på alpha4 beta1 integrinfarvning i scc154 shp16 og scc154 shluc mus fremmedhad modeller; n = 5. d Average score of alpha4 beta1 integrin staining in HPV positive SCC154 (n = 7) and HPV negative SQD9 (n = 10) mouse xenograft models. a-D P-værdier beregnes ved tosidet t-test
p16 stimulerer lymphangiogenese og nodal spredning i HPV-positiv HNSCC
disse resultater forklarer stadig ikke forekomsten af de lignende fjerne tilbagefaldshastigheder hos HPV/p16-positive og negative hnscc-patienter og forklarer bestemt ikke den meget signifikante sammenhæng mellem HPV-positive og positivitet og nodal involvering beskrevet i Vores og flere andre undersøgelser . Dette er især vigtigt, da det implicerer tilstedeværelsen af et højt lokalt metastatisk potentiale i HPV-positiv HNSCC. Interessant lymfangiogenese, som angiogenese, fremmer tumormetastase ved at inducere væksten af nye lymfekar i tumoren og ved at forbedre cellehandel til lymfeknuder. Desuden er øget lymfekardensitet i tumorer forbundet med øget metastase til lymfeknuder. . Derfor vurderede vi dannelsen af lymfekar ved hjælp af homolog lymfekar hyaluronan (LYVE-1) immunfarvning i shluc-og shp16-musetumorer. Vi fandt ud af, at P16-undertrykkelse resulterede i lavere lymfekardensitet i HPV/p16-positive fremmedbilleder, hvilket tyder på en dobbelt rolle af p16 i metastase (Fig. 2b).
for at forstå funktionen af p16 fokuserede vi på integriner, da disse proteiner accepteres som nøgleregulatorer for angiogenese og lymfangiogenese . Desuden er bindingen af p16 til integriner og tab af cellespredning tidligere dokumenteret . Integriner såsom alpha4 beta1 er vigtige modulatorer af lymfangiogenese . Derfor vurderede vi tilstedeværelsen af alpha4 beta1 integrin i scc154 shluc og scc154 shp16 musetumorer. Although not statistically significant (p = 0.09), shluc tumors showed a higher percentage of integrin compared to shp16 tumors (Fig. 2c). In line with SCC154 shRNA xenografts, tumors from HPV/p16 positive SCC154 xenografts showed higher percentage of alpha4 beta 1 integrin compared to tumors from HPV/p16 negative SQD9 xenografts (Fig. 2d).