hovedformålet med negativ farvning er at studere den morfologiske form, størrelse og arrangement af bakteriecellerne, der er vanskelige at plette. eg: Spirilla. Det kan også bruges til at plette celler, der er for sarte til at blive varmefastgjort.

det bruges også til at forberede biologiske prøver til elektronmikroskopi. Det bruges til at se vira, bakterier, bakteriel flagella, biologiske membranstrukturer og proteiner eller proteinaggregater, som alle har en lav elektronspredningskraft. Det bruges også til undersøgelse og identifikation af vandige lipidaggregater som lamellære liposomer (le), inverterede sfæriske miceller (M) og inverterede sekskantede hii cylindriske (H) faser ved negativ farvningstransmissionselektronmikroskopi.

princippet om negativ farvning

negativ farvning kræver et surt farvestof, såsom India Ink eller Nigrosin.Indien blæk eller Nigrosin er en sur plet. Dette betyder, at pletten let opgiver en hydrogenion (proton), og farvestoffets kromofor bliver negativt ladet. Da overfladen af de fleste bakterieceller er negativt ladet, afviser celleoverfladen pletten. Glaset af diaset vil plette, men bakteriecellerne vil ikke. Bakterierne vil dukke op som klare pletter mod en mørk baggrund.

reagenser med negativ farvning

India ink

Nigrosin
Nigrosin 100 gm/L, Formalin 5 ml/L i vand

Procedure for negativ farvning

1. Placer en meget lille dråbe (mere end en løkke Fuld, mindre end et frit faldende dråbe fra dropper) af nigrosin nær den ene ende af et godt rengjort og flammet dias.

2. Fjern en lille mængde af kulturen fra skråningen med en inokuleringssløjfe og spred den i dråben uden at sprede dråben.

3. Brug et andet rent objektglas til at sprede pletten, der indeholder organismen, ved hjælp af følgende teknik.

4. Hvil den ene ende af det rene objektglas i midten af objektglasset med pletten. Vip det rene objektglas mod dråben, der danner en spids vinkel, og træk det glide mod dråben, indtil det berører dråben og får det til at sprede sig langs kanten af sprederglasset. Vedligeholdelse af en lille spids vinkel mellem gliderne, skub sprederglasset mod den rene ende af objektglasset, der farves, og træk dråben bag sprederglasset og fremstil en bred, jævn, tynd udstrygning.

5. Lad smøret tørre uden opvarmning.

6. Fokuser et tyndt område under oliedypning og observer de ufarvede celler omgivet af den grå plet.

Procedure for visning i Transmission Electron Microscope (TEM)

1. Hold et belagt gitter flim side op i et par selvspændende tang.
2. lav en 1: 1 blanding af prøve og negativ plet (f.eks. 2% uranylacetat eller 2% natrium-eller kaliumphosphotungstate, pH 7,4). Tilføj 5 liter til gitteret. Mindre partikler adsorberer hurtigere til gitteroverfladen end større partikler.
   alternativt kan prøven blandet med fikseringsmiddel sættes til gitteret før efterfølgende negativ farvning.
3. inkuber i 30-90 sekunder, fjern derefter overskydende væske med den revne kant af et
   stykke filterpapir.
4. lufttørre og undersøge i TEM.

resultater af negativ farvning