bakteriofager, også kaldet fager, er vira, der specifikt inficerer bakterier, og vi kan bekræfte deres tilstedeværelse og kvantificere dem ved hjælp af et værktøj kaldet plakassay. Bakteriofager inficerer deres modtagelige værter ved først at binde sig til bakteriecellevæggen og injicere deres genetiske materiale. Derefter kaprer de cellens biosyntetiske maskiner for at replikere deres DNA og producere adskillige afkom fagpartikler, som de derefter frigiver ved at lysne og dræbe værtscellen.
denne lytiske aktivitet er grundlaget for en meget anvendt fagoptællingsteknik kendt som plakassay eller dobbelt agarlagsassay. Her fremstilles en bakteriofagblanding først i en smeltet næringsstofbuljong indeholdende agar med lav koncentration. Alle bakterier, der anvendes i blandingen, skal være i LIVE og aktivt opdele i logfasen af deres vækst, hvilket vil sikre, at en stor procentdel af bakterierne er levedygtige og i stand til at danne en tæt græsplæne omkring plaketterne. Dernæst spredes denne smeltede bakteriefagagarblanding over et mere fast, koncentreret agar næringsmedium, som allerede er størknet på en petriskål. Ved inkubation ved stuetemperatur størkner agar-fag-bakteriebuljong med lav koncentration også til dannelse af et blødt agaroverlay.
Her kan bakteriecellerne udlede yderligere næringsstoffer fra bundlaget og bør hurtigt formere sig for at producere en sammenflydende græsplæne af bakterier. Da fagpartikler imidlertid også er til stede i det bløde lag, vil disse inficere og replikere deres genetiske materiale i bakterierne, der kulminerer i cellelyse, som frigiver flere afkom. Disse fagafkom inficerer derefter de nærliggende celler, da bakteriefaglagets halvfaste tilstand begrænser deres bevægelse til mere fjernt placerede værtsceller. Denne cyklus af infektion og lysis fortsætter over flere runder og dræber et stort antal bakterier i et lokaliseret område. Virkningen af de nærliggende celler, der ødelægges, er at producere et enkelt cirkulært klart område, kaldet en plak, som kan ses med det blotte øje, hvilket effektivt forstærker bakteriens lytiske aktivitet af Fagen og muliggør deres opregning.
antallet af plaketter på en petriskål betegnes som Plakdannende enheder eller PFU ‘ er, og forudsat at den oprindelige bakteriofagkoncentration var tilstrækkeligt fortyndet, skulle den direkte svare til antallet af infektive fagpartikler i den oprindelige prøve. Denne teknik kan også bruges til karakterisering af plakmorfologi, til at hjælpe med at identificere fagtyper eller til at isolere fagmutanter. I dette laboratorium lærer du, hvordan du udfører plakassayet til optælling af fager ved hjælp af T7-Fagen af E. coli som et eksempel.
Identificer først et egnet medium til dyrkning af værtsbakteriecellerne og bakteriofagen. Her blev lysogeni bouillon, eller LB medium, brugt til at dyrke E. coli og T7 fag. Derefter skal du tage tre rene glasflasker og mærke dem med medier, navn og derefter den første som LB-bouillon, den anden som LB-bund Agar og den tredje som LB-Top Agar. Vej nu fire gram præformuleret LB-pulver i tre sæt og overfør derefter et sæt vejede tørrede medier i hver flaske. Tilsæt 200 ml vand til den første flaske. Bland indholdet ved hjælp af en magnetisk omrørestang.
derefter bringes den endelige pH til 7,4 ved tilsætning af natriumhydroksid eller saltsyre ved hjælp af en pH-meter og konstant omrøring. Gentag også vandtilsætningen og pH-justeringen for de to andre resterende flasker. Vej nu tre gram agarpulver ud og føj det til den anden flaske for at fremstille en 1,5% bundagar. Til sidst vejer 1. 2 gram agar og tilføje det til den tredje flaske til at gøre .6% LB top agar. Bouillonbetingelsen i bottle one behøver ikke en agartilsætning. Læg flasken halvt tæt på, og steriliser derefter mediet ved autoklavering ved 121 grader Celsius i 20 minutter. Når du er færdig, skal du fjerne medieflaskerne fra autoklaven og straks dreje flaskehætterne for at lukke dem helt for at forhindre forurening. Hold LB-bouillon og LB-Top Agar medier på bænken til senere brug. Anbring den LB-bund Agar til afkøling i et vandbad, der er forudindstillet til cirka 45 grader Celsius.
når den LB-bund agar når cirka 45 grader Celsius, skal du overføre den til arbejdsbænken. Steriliser derefter arbejdsområdet ved hjælp af 70% ethenol. Derefter tilsættes 450 mikroliter sterilt et molært calciumchlorid til den smeltede bundagar for at opnå en endelig koncentration på 2.25 millimolar. Drej forsigtigt flasken for at blande. Sæt derefter syv rene petriskåle ud. Mærk hver skål i bunden med medienavnet og forberedelsesdatoen. Hæld derefter 15 ml af bundagaren i hver af de syv petriskåle. Lad pladerne indstille i et par timer eller natten over ved stuetemperatur. Når de er indstillet, kan kulturpladerne opbevares ved fire grader Celsius i flere dage, hvis det er nødvendigt, på hovedet for at minimere kondens. Overfør petriskålene fra køleskabet fire grader Celsius til en 37 grader Celsius inkubator en time før analysen.
dagen før analysen skal præformeres, skal E. coli dyrkes. Her blev 10 mikroliter E. coli-kultur inokuleret i 10 ml LB-bouillon. Placer bakterierne til at vokse natten over i en rystende inkubator indstillet til 37 grader Celsius ved 160 omdr. / min. Fjern derefter bakteriekulturen fra inkubatoren på dagen for analysen. Frø en frisk 10 ml frisk lb bouillon med 0,5 ml af overnatningskulturen. Placer disse celler for at vokse til en rystende inkubator indstillet til 37 grader Celsius ved 160 O / min. Brug derefter et spektrofotometer til at kontrollere, hvornår denne kultur når logfasevækst, angivet med en optisk densitet på 0,5 til 0,7. Når OD når dette niveau, skal du stoppe inkubationen ved at overføre cellekulturen til bænken. De er nu klar til at blive brugt til fagoverlejringsassay.
Fagtitere kan variere eksponentielt på tværs af forskellige fagtyper og prøver. Så for at tælle dem effektivt, bør de fortyndes for at generere en bred vifte af fagkoncentrationer. På dagen for analysen genereres en række fagfortyndinger, der spænder fra en tiendedel til en millionste koncentrationer efter en 10 gange fortyndingsteknik. For at opnå statistisk signifikante og nøjagtige data skal du udføre den serielle fortynding i tre eksemplarer.
smelt derefter den størknede lb-top agar ved hjælp af en mikrobølgeovn. Placer det derefter i et vandbad, der er forudindstillet ved 45 grader Celsius i en time. Efter en time skal du samle Petriskålene, der indeholder det nederste agarlag fra inkubatoren. Mærk pladerne med fagkoncentration og analysedato. Sæt derefter syv rene reagensglas ud. Mærk hvert reagensglas med det serielle fagfortyndingsnummer, og betegn et som kontrol.
når lb-top agar når 45 grader Celsius, skal du overføre den til arbejdsbænken. Nu tilsættes 450 mikroliter af en molær calciumchlorid til 200 milliliter agar for at gøre en endelig koncentration på 2,25 millimolar. Drej forsigtigt flasken for at blande. Derefter tilsættes 35 ml lb-top agar og fire milliliter bakteriel suspension til et sterilt konisk rør. Drej forsigtigt rundt for at fordele cellerne jævnt, men undgå at ryste for at forhindre skumdannelse.
nu, alikvot fem milliliter af denne bakterie – top agar blanding til hver af de syv reagensglas. Derefter overføres 100 mikroliter af de serielt fortyndede bakteriofagprøver og kontrolmedier, som simpelthen skal være medier uden bakteriofag, til de respektfuldt mærkede reagensglas. Drej blandingen forsigtigt for at sikre korrekt blanding. Overfør forsigtigt fem milliliter bakteriofagblanding på den respektive Petriplade. Spred blandingen jævnt over hele overfladen ved forsigtigt at hvirvle Petripladen.
når alle petripladerne er lagdelt med blandingen, Tillad størkning af det øverste lag ved at inkubere ved stuetemperatur i 15 minutter. Efter afslutningen af disse trin gentages processen for det andet og derefter det tredje sæt af Petriskålene ved hjælp af de resterende to sæt fagfortyndinger. Forsegl hver skål med parafilm og inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter. Placer kulturpladen på hovedet ved en passende temperatur i 24 timer, eller indtil der udvikles plader. Her blev plader anbragt i en 37 grader Celsius inkubator i en dag, en stimulerende vækstbetingelse for E. coli og T7-fag.
plaketter vises efter en til fem dages inkubation afhængigt af bakteriearten, inkubationsbetingelserne og valget af medium. Her var plaketter synlige efter en dag med inkubation ved 37 grader Celsius. Begynd med at kontrollere pladerne markeret kontrol og sikre, at der ikke blev dannet plaketter i disse plader, da dette ville indikere viral kontaminering. For at bestemme fagtiteren i den originale prøve skal du først starte med pladerne, der indeholder den mest fortyndede fagprøve, og tælle pladerne uden at fjerne lågene og markere dem for at angive, hvilke der allerede er talt. Gentag optællingen for hver plade i hvert sæt. Nogle plader kan have for mange eller for få plader til at blive talt. Overvej 10 til 150 som et ideelt antal plak.
generer derefter en tabel, der viser plaknummerværdierne for de forskellige fortyndinger og replikater. Beregn derefter de gennemsnitlige plakantalværdier for fortyndingspladerne, der indeholdt det ideelle antal plakantal. I dette eksempel var disse det gennemsnitlige antal plaketter dannet i 10 til minus tre og 10 til minus fire fortyndingsplader. Juster nu for fagfortyndingsfaktor ved at dividere de opnåede gennemsnitlige plakværdier med de respektive fagfortyndingsfaktorer. Her blev det gennemsnitlige antal plaketter dannet til 10 til minus tre og 10 til minus fire fortyndingsplader divideret med deres respektive fortyndingsfaktorer for at opnå antallet af plakdannende enheder eller PFU ‘ er i 100 mikroliter fagblanding. Milliliter multipliceres de genererede værdier med 10, da der kun blev anvendt 100 mikroliter fagfortyndingsblanding under klargøringstrinnet til bakteriofagoverlejring, hvilket frembragte en yderligere fortyndingsfaktor på 10. Til sidst beregnes gennemsnittet af værdierne opnået fra de forskellige fortyndingsplader. Dette vil give det gennemsnitlige antal PFU ‘ er pr. Antallet af PFU ‘ er svarer til antallet af infektive fagpartikler i den oprindelige prøve.