shRNA versus siRNA

RNA-interferens (RNAi) er en biologisk proces, hvor RNA-molekyler bruges til at hæmme genekspression. Typisk oprettes korte RNA-molekyler, der er komplementære til endogent mRNA, og når de indføres i celler, binder de til mål-mRNA ‘ et. Binding af det korte RNA-molekyle til mål-mRNA ‘et inaktiverer funktionelt mål-mRNA’ et og fører undertiden til nedbrydning af mål-mRNA ‘ et.

historisk set er to typer korte RNA-molekyler blevet anvendt i RNAi-applikationer. Lille interfererende RNA (siRNA) er typisk dobbeltstrengede RNA-molekyler, 20-25 nukleotider i længden. Når siRNA transficeres til celler, hæmmer siRNA målet mRNA forbigående, indtil de også nedbrydes i cellen. Små hårnål-RNA ‘ er (shRNA) er sekvenser af RNA, typisk omkring 80 basepar i længden, der inkluderer et område med intern hybridisering, der skaber en hårnålestruktur. shRNA-molekyler behandles i cellen for at danne siRNA, som igen slår genekspression ned. Fordelen ved shRNA er, at de kan inkorporeres i plasmidvektorer og integreres i genomisk DNA til længerevarende eller stabil ekspression og dermed længere nedbrydning af mål-mRNA ‘ et.

effektiv ekspression af shrna ‘er fra RNA-Polymerase III-promotorer

små RNA’ er inklusive shrna ‘ er transkriberes endogent med RNA-Polymerase III (Pol III). Dette adskiller sig fra cDNA ‘er, der transkriberes ved hjælp af RNA-polymerase II. for at garantere høj ekspression af shrna’ er bruger Cellecta promotorer, der specifikt binder Pol III, U6-og H1-promotorerne. Både U6-og H1-promotorerne fungerer godt til at udtrykke høje niveauer af shRNAacross mange celletyper sammenlignet med Pol II-promotorer som CMV og EF1, som ikke udtrykker shrna ‘ er så effektivt på grund af deres lille størrelse. Derudover fungerer Pol II-promotorer, der bruges til at udtrykke shMIRs, muligvis ikke i de fleste celletyper, hvor U6 og H1 fungerer godt.

Lentivirale vektorer muliggør Permanent nedlukning af mål

shRNA bliver stabilt integreret i værtscellegenomet. Når cellerne deler sig, overføres shRNA til datterceller. Brug af lentivirale vektorer til ekspression af shrna ‘ er giver permanent nedslag uden at skulle transficere cellerne flere gange. For at finde ud af mere om, hvordan lentivirale vektorer fungerer, se vores lentiviral vector system side.

optimering af shRNA-Design

design af effektive shrna ‘ er er afgørende for effektiv RNAi-nedslagsscreening. Ud over at vælge den optimale sekvens er der en række strukturelle faktorer, der påvirker shRNA-effekten. Derudover udgør stem-loop hårnålestrukturen i shRNA problemer for bibliotekskonstruktion og forstærkning. At skabe repræsentative kvalitets shRNA-biblioteker, vi har fokuseret en betydelig indsats for at optimere effektiv af shRNA-indsatserne i vores biblioteker. Vi har udviklet en intern algoritme til at forudsige de mest effektive shRNA-sekvenser, og kombinere dette med offentliggjorte data om validerede sekvenser, når vi konstruerer vores biblioteker. Vi har også optimeret strukturen af shRNA til bibliotekskonstruktion.

for effektivt at teste shrna-strukturvariationer i stor skala udviklede vi en shRNA-effektivitetstestteknologi med høj kapacitet baseret på en reporteranalyse. Det blev tidligere påvist, at et reportergen (såsom GFP) med en 3′ – fusion til et cDNA-fragment eller kort oligonukleotid fra et målgen effektivt kunne bruges til at overvåge effektiviteten af siRNA og shRNA-konstruktioner mod dette målgen. Baseret på disse fund udviklede vi en lentiviral reportervektor til identifikation af funktionelle shRNA-konstruktioner (Figur 1). Vores proprietære shRNA-testreportervektor giver mulighed for kloning af både shRNA-skabelon nedstrøms for H1-promotoren og målsekvenserne i 3′ – slutningen af GFP-reporteren. Når denne konstruktion transduceres til celler, producerer transkription fra H1-promotoren shRNA, mens transkription fra CMV-promotoren genererer et GFP-sense-mål mRNA-fusionstranskript, der kan bruges som reporter til screening af funktionelle shrna ‘ er.

kort over shRNA-target lentiviral reporter-konstruktion integreret i genomisk DNA og mekanisme til nedslagning af GFP-target reporter. Cellerne transduceret med funktionelle shRNA-konstruktioner vil have lave GFP mRNA-niveauer, mens ikke-funktionelle shrna ‘ er tillader et højt niveau af GFP mRNA-ekspression.

for at optimere strukturen af shRNA konstruerede vi et shRNA-målbibliotek i shRNA-valideringsvektoren til 150 shrna ‘ er, hvor hver shRNA er konstrueret i 40 forskellige designs beskrevet i litteraturen.

Vi udførte RNAi-skærme i CHO-Treks-celler transduceret med dette 150h40 stregkodede shRNA-Målbibliotek og målte repræsentation (i biblioteket og transducerede celler) og nedslag effektivitet af hver shRNA-konstruktion. Nogle repræsentative data fra denne screening er vist nedenfor.

de ti bedste designs blev valgt ud fra dem, der havde den højeste målnedslagsaktivitet, lige forstærkningseffektivitet af samme design samlet oligonukleotider og ligelig repræsentation af shrna ‘ er med samme design i de samlede RNAi-biblioteker. Nedslagseffektiviteten af tre p53 shrna ‘ er konstrueret med disse 10 bedste designs i en lentiviral vektor blev yderligere analyseret ved RT-PCR efter transduktion i musefibroblastceller.