som med DNA-isolering er forskere ofte afhængige af RNA-isolationssæt for at gøre deres liv lettere. For nylig offentliggjorde vi en blog om DNA-rensning uden et sæt, der skitserede flere grunde til, at det at gøre noget uden et sæt har fordele: mindre plastaffald, mindre omkostninger og mindre at være tilbage med en masse tilfældige løsninger, når alle spin-kolonnerne løber tør. I denne artikel dækker vi det grundlæggende ved at isolere RNA uden et kit.

Tips til at arbejde med RNA (uanset om du bruger et kit eller ej)

selvom det siger sig selv, at man skal være forsigtig, når man udfører nogen form for DNA-eller RNA-oprensning for at undgå forurening, skal du være ekstra forsigtig, når du udfører RNA-ekstraktion. RNA er i sagens natur ikke så stabilt som DNA – det er enkeltstrenget, og dets ribosegrupper er modtagelige for hydrolyse og varmeforringelse. Desuden er Rnaser, der nedbryder RNA, særligt hårdføre proteiner, der findes i og på alt, herunder din hud. Her er nogle generelle tips til at arbejde med RNA, selvom du bruger et sæt:

• Brug altid handsker, da Rnaserne på dine hænder kan nedbryde RNA.
• hold et rent arbejdsområde, som kan omfatte sprøjtning af din bænk med et produkt for at slippe af med Rnaser som f.eks.
• når du høster væv, celler, planter, svampe eller bakterier, skal du holde prøverne kolde og arbejde hurtigt for at afbøde RNA-nedbrydning.
• sørg for at bruge DEPC-behandlet eller Rnasefrit vand. Hvis du bruger DEPC-behandlet vand, skal du autoklavere vandet for at inaktivere DEPC.
• sørg for, at plastik eller glasvarer, der anvendes, er Rnasefri. Rnasefri plastvarer er let tilgængelige fra videnskabelige leverandører, og glasvarer skal behandles med en DEPC-opløsning i 1 time og autoklaveres for at fjerne resterende DEPC. Alternativt kan glasvarer bages ved 180 liter C i mindst 4 timer.
• hvis din(e) endelige RNA-prøve (er) resuspenderes i vand eller TE-buffer, skal du opbevare dem i en fryser på -80 liter C for at forhindre RNA-nedbrydning. De vil nedbrydes i en -20 liter C fryser.

RNA-ekstraktionsmetoder udviklede sig til en simpel protokol, der stadig anvendes i dag

der er mange alternative metoder til isolering af DNA uden et kit. Det er dog ikke tilfældet for RNA-ekstraktion og oprensning. Der er en simpel metode, der virker, og variationer til denne metode. En stor hindring for at udvikle protokoller til isolering af RNA var, at Rnaser almindeligvis findes i celler, og uden noget at blokere Rnaseaktivitet ved cellelyse nedbrydes RNA. For effektivt at isolere intakt RNA ville der kræves et hurtigt, stærkt proteindenatureringsmiddel – noget der brød ned Rnaser, før Rnaser havde en chance for at nedbryde RNA ved cellelyse.

i slutningen af 1970 ‘ erne viste Chirgvin og kolleger, at et stærkt protein denatureringsmiddel, guanidiniumthiocyanat, gjorde netop dette (Chirgvin et al., 1979). De udviklede en protokol beregnet til isolering af RNA fra rottepletter, hvor de homogeniserede Milter i en guanidiniumthiocyanatopløsning og spundet homogenatet ned for at fjerne det uopløselige materiale. Derefter blev homogenatet indlæst på cæsiumchloridgradienter og ultracentrifugeret i op til 20 timer for at adskille det intakte RNA fra DNA og proteiner. Selvom det er meget effektivt til at isolere total RNA, kræver denne metode meget tid og afhængigt af hvor mange prøver du måtte have, adgang til en eller flere store, dyre ultracentrifuge.

Figur 1: En oversigt over de forskellige trin i RNA-ekstraktion.

forskere ved NIH i midten af 1980 ‘ erne satte sig for at udvikle en protokol, der sprang over ultracentrifugationen helt. Det viste sig, at RNA effektivt kunne adskilles fra DNA og proteiner ved hjælp af en simpel ekstraktionsprotokol med guanidiniumthiocyanat-phenolchloroform. Ved denne metode homogeniseres og lyseres prøver stadig i en guanidiniumthiocyanatopløsning. I stedet for RNA-adskillelse ved anvendelse af cæsiumchloridgradienter tilsættes vandmættet phenol, natriumacetat og chloroform til homogenatet og rystes. Efter en hurtig centrifugering (ikke ultracentrifugering!), lagene af phenol og chloroform adskilles, og RNA tilbageholdes i det øverste, vandige lag, mens DNA og andre proteiner tilbageholdes i interfasen og det nederste, organiske lag. Det øverste vandige lag ekstraheres, og RNA kan derefter udfældes isopropanol. Denne metode reducerede den tid, det tog at isolere RNA fra 20+ timer til omkring 4 timer, og variationer på denne no-kit-metode anvendes stadig i vid udstrækning i dag (Chomcynski og Sacchi, 2006).

se vores protokol til RNA-ekstraktion!

gør den enkle protokol endnu mere idiotsikker (stadig uden et sæt!)

som nævnt ovenfor kræver arbejde med RNA at holde dine prøver kolde indtil homogenisering og cellelyse. Dette kan være udfordrende afhængigt af din laboratoriesituation eller vævsopsamlingsmetode, så bioteknologiske virksomheder har markedsført flere produkter, der hjælper med at strømline denne proces yderligere og/eller stabilisere RNA under vævsopsamling og homogenisering. De mest kendte af disse produkter er Trisol-kar (også kaldet Tri-reagens-Karrusol, Trisol-Karrusol, Trisol-karrusol og solgt af mange forskellige virksomheder). Det er en all-in-one syre-guanidinium-phenol opløsning, der kombinerer homogeniseringsopløsningen og phenol tilsætning af den oprindelige No-kit protokol i et trin. Efter homogenisering fjernes uopløseligt materiale via centrifugering, og supernatanten ekstraheres med chloroform som ved ovennævnte no-kit-metode.

forskere har også udviklet måder at “stabilisere” RNA i væv før cellelyse. Disse produkter er ammoniumsulfatbaserede opløsninger, der virker ved at hæmme Rnaseaktivitet i celler eller væv – de stabiliserer faktisk ikke RNA-molekylerne kemisk (1974). Derudover, ThermoFisher giver en protokol om, hvordan man integrerer rnalater Lars ved brug af Trisol-larsol, og ammoniumsulfatstabiliserende opløsninger kan fremstilles internt.

et almindeligt problem med RNA-ekstraktionsmetoder uden kit er overførsel af DNA, der potentielt kan komplicere resultaterne af en nedstrøms applikation, såsom kvantitativ PCR til vurdering af genekspression. Der er flere ting, som forskere kan gøre for at bekæmpe dette problem. Først og fremmest skal du være opmærksom på dine ekstraktioner – hvis du har brug for virkelig rent RNA, er det vigtigt at sørge for, at når du ekstraherer, kun tager det vandige lag for at undgå overførsel af DNA fra bunden, organisk lag. Et andet trick er at udfælde RNA ‘ et ved hjælp af lithiumchlorid. LiCl-opløsninger udfælder selektivt RNA, men ikke DNA og proteiner. Endelig vil brug af en DNase (der er flere DNase-produkter på markedet at vælge imellem) på din resuspenderede RNA-prøve hjælpe med at sikre, at DNA-forurening ikke er et problem.

Chirgvin JM, MacDonald RJ, Rutter VJ (1979) isolering af biologisk aktiv ribonukleinsyre fra kilder beriget i ribonuklease. Biokemi 18: 5294-5299. https://doi.org/10.1021/bi00591a005

Chomczynski P, Sacchi N (2006) The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate–phenol–chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols 1:581–585. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.83