abstrakt

Eyebright, Euphrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae), er en medicinalplante, der traditionelt anvendes i Europa til behandling af forskellige sundhedsforstyrrelser, især som øjenvask til behandling af øjenlidelser såsom konjunktivitis og blepharitis, der kan være forbundet med bakterielle infektioner. Nogle Euphrasia-arter er tidligere rapporteret at indeholde æterisk olie. Sammensætningen og bioaktiviteten af E. rostkoviana olie er imidlertid ukendt. Derfor undersøgte vi i denne undersøgelse den kemiske sammensætning og antimikrobielle aktivitet af eyebright æterisk olie mod nogle organismer forbundet med øjeninfektioner: Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Pseudomonas aeruginosa og Candida albicans. GC-MS-analyse afslørede mere end 70 Bestanddele med n-geksadecansyre (18,47%) som hovedbestanddel efterfulgt af thymol (7,97%), myristinsyre (4,71%), linalool (4,65%) og anethol (4,09%). Den essentielle olie viste antimikrobiel virkning mod alle testede organismer med undtagelse af P. aeruginosa. Den bedste aktivitet blev observeret mod alle grampositive bakterier, der blev testet med de mindste hæmmende koncentrationer på 512 liter/mL. Dette er den første rapport om den kemiske sammensætning af E. rostkoviana æterisk olie og dens antimikrobielle aktivitet.

1. Indledning

Eyebright, Euphrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae), er blevet brugt i Europa i århundreder som en traditionel medicin til behandling af forskellige sygdomme. Afkog og infusioner af blomstrende luftdele bruges mod tør hoste, hæshed, symptomatisk behandling af forkølelse, ørepine og hovedpine, høfeber, purulent hudlæsion eller katarralsygdomme i tarmkanalen, men især som øjenvask til behandling og forebyggelse af øjenlidelser såsom konjunktivitis, blepharitis, træthed i øjnene, purulent okulær betændelse og sties . Brugen af eyebright tea er også blevet rapporteret i etnoveterinærmedicin til behandling af koøjeinfektion . På trods af århundreder af den traditionelle anvendelse til behandling af øjenlidelser har der kun været et prospektivt kohorteforsøg udført, der bekræfter effektiviteten af Euphrasia øjendråber til behandling af konjunktivitis og en enkelt klinisk undersøgelse, der undersøger effekten af lokal anvendelse af øjendråber på antibiotikaforbrug hos nyfødte . Desuden har spektret af antimikrobielle virkninger indtil de nylige rapporter om anticandidal og antibakteriel aktivitet af nogle Euphrasia-ekstrakter været fuldstændig ukendt.

den terapeutiske virkning af E. rostkoviana kan hovedsageligt tilskrives dets antioksidante, antiinflammatoriske og antimikrobielle aktivitet . Blandt de forbindelser, der tidligere er identificeret i E. rostkoviana-ekstrakter, kan apigenin, luteolin, kaempferol, kvercetin, koffeinsyre, kumarinsyre og rosmarinsyre være ansvarlige for den antimikrobielle virkning. Selvom tilstedeværelsen af æterisk olie (EO) i E. officinalis L. og E. stricta Kunt tidligere er rapporteret, er sammensætningen og bioaktiviteten af E. rostkoviana EO ukendt. Derfor undersøgte vi i denne undersøgelse den kemiske sammensætning og antimikrobielle aktivitet af eyebright EO mod panelet af tre Gram-positive bakterier (Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus og S. epidermidis) og tre Gram-negative bakterier (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae og Pseudomonas aeruginosa) og en gær (Candida albicans), organismer, der ofte er forbundet med øjeninfektioner.

2. Materiale og metoder

2.1. Kemikalier og plantemateriale

de autentiske standarder borneol, camphor, carvacrol, carvone, caryophyllen, p-cymen, estragol, eucalyptol, Limonen, linalool, menthol, menthone, krit-myrcen, krit-terpinen og thymol til identifikation af EO-komponenter samt kontrolantibiotika ciproflocacin og tioconasol blev købt hos Sigma-Aldrich (Prag, Tjekkiet). Geksan (Merck, Prag, Tjekkiet), dimethylsulfoksid (DMSO) (Lach-Ner, Neratovice, Tjekkiet) og mellem 80 (Sigma-Aldrich, Prag, Tjekkiet) blev anvendt som opløsningsmidler. Det plantemateriale, der blev anvendt til eo-destillationen, blev købt fra kommercielle kilder (F-DENTAL, Hodon Karun, Tjekkiet). EO blev ekstraheret ved hydrodestillation under anvendelse af Clevenger type apparat.

2, 2. Kemisk analyse af EO ved gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS)

E. rostkoviana EO blev analyseret af GC-MS ved hjælp af Agilent 7890A GC koblet til Agilent 5975c enkeltkvadrupol massedetektor udstyret med en HP-5ms-søjle (30 m liter 0,25 mm, 0,25 liter film) fra Agilent (Santa Clara, CA, USA). Geksan blev anvendt som opløsningsmiddel, og prøvevolumenet på 1 liter blev injiceret i delt tilstand (forhold 20 : 1) i injektoren opvarmet til 250 liter C. startovnstemperaturen blev indstillet til 60 liter C i 3 minutter, programmeret til 230 liter C med en hastighed på 3 liter C/min og derefter holdt konstant i 10 minutter. Helium blev anvendt som bæregas med strømningshastigheden på 1 mL/min. MS-analysen blev udført i fuld scanningstilstand, og elektronioniseringsenergien blev sat til 70 eV. Identifikationen af individuelle komponenter var baseret på sammenligningen af deres massespektre og relative retentionsindekser med National Institute of Standards and Technology Library (NIST, USA) og litteratur samt coinjektion af autentisk standard.

2, 3. Bakteriestammer og dyrkningsmedier

standardstammerne af tre grampositive bakterier Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213 og S. epidermidis ATCC 12228, tre gramnegative bakterier Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 og Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 og en gær Candida albicans ATCC 10231 blev opnået fra Oksoid (Basingstoke, Det Forenede Kongerige). Kation justeret Mueller-Hinton bouillon (MHB) og Sabouraud dekstrose bouillon (SDB) blev anvendt som dyrkningsmedier til henholdsvis antibakteriel og antifungal mikrofortyndingsanalyse og blev ækvilibreret med Trisbufret saltvand (Sigma-Aldrich, Prag, Tjekkiet). Mueller-Hinton agar (MHA) og Sabouraud dekstrose agar (SDA) blev anvendt til efterfølgende bestemmelse af henholdsvis bakteriedræbende og fungicide koncentrationer. Alle medier blev købt fra Basingstoke (Basingstoke, Storbritannien).

2, 4. Minimum inhiberende koncentration (Mic) bestemmelse

MICs blev bestemt ved anvendelse af in vitro bouillon mikrofortyndingsmetode efter retningslinjerne fra Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) modificeret i henhold til de foreslåede anbefalinger til effektiv vurdering af det antiinfektive potentiale af naturlige produkter ved anvendelse af 96-brønds mikrotiterplader. Kort sagt blev EO opløst i DMSO med tilsætning af mellem 80 og to gange serielle fortyndinger blev fremstillet i MHB for bakterier og i SDB for gæren, mens de testede koncentrationer varierede fra 4 til 2048 liter/mL. Inokulumet blev fremstillet ud fra kulturer natten over, således at de indledende CFU-koncentrationer i mikropladerne var henholdsvis 5 liter 105 og 2 liter 103 CFU/mL for bakterier og gær. De inokulerede plader blev undersøgt efter 24 h inkubation ved 35 liter C og endnu en gang efter 48 timer i tilfælde af C. albicans. Den mikrobielle vækst blev målt spektrofotometrisk ved Multiscan Ascent Microplate fotometer (Thermo Fisher Scientific, Valtham, USA) ved 405 nm. MICs blev udtrykt som de laveste koncentrationer, der kunne hæmme 80% af bakterievæksten sammenlignet med den positive vækstkontrol. Eksperimenterne blev udført i tre eksemplarer i tre uafhængige tests, og medianværdier blev anvendt til beregning af mikrofoner. På grund af den nyligt rapporterede mulighed for EO-Flygtige komponenters indflydelse på den mikrobielle vækst i tilstødende brønde blev positive vækstkontrolrækker indsat mellem EO-fortyndingsrækkerne for at detektere eventuel vækstpåvirkning. De anvendte opløsningsmidler hæmmer ikke bakterievæksten ved testede koncentrationer. Som referenceantibiotika for henholdsvis bakterier og gær blev ciproflocacin anvendt.

2, 5. Minimum bakteriedræbende koncentration (MBC) og Minimum fungicid koncentration(MFC) bestemmelse

alikvoterne på 20 liter blev overført fra hver brønd uden mikrobiel vækst til MHA-pladerne (SDA-plader til C. albicans) efter henholdsvis 24 h og 48 h inkubation af bakterier og gær testet. Pladerne blev derefter inkuberet i 24 timer ved 35 liter C. MBC og MFC blev evalueret som et fald på 99,9% i CFU sammenlignet med inokulum, alle udført i tre eksemplarer i tre uafhængige tests.

3. Resultater og diskussion

3.1. Kemisk karakterisering af olier og bioaktive fraktioner bestanddele

eo hydrodestillation af Clevenger-type apparat gav 0,02% (vægt/v) gulbrun olie, der har tendens til at størkne ved stuetemperatur, hvilket sandsynligvis skyldes en høj andel fedtsyrer (32,23% i alt). GC-MS-analyse af EO afslørede tilstedeværelsen af mere end 70 bestanddele, hvor palmitinsyre (18,47%) var den mest rigelige komponent efterfulgt af thymol (7,97%), myristinsyre (4,71%), linalool (4,65%), anethol (4,09%), linolensyre (3,81%), geksahydrofarnesylacon (3,16%), laurinsyre (2.79%), α-terpineol (2.39%), and borneol (2.39%). The main compounds are shown also in the chromatogram (Figure 1) and the complete list of EO constituents is presented in Table 1.

Figur 1

typisk kromatogram af Euphrasia rostkoviana æterisk olie. Hovedkomponenterne er mærket i henhold til rækkefølgen af deres retentionstider. (12) Linalool; (22) Kurt-terpineol; (34) anethol; (36) thymol; (37) carvacrol; (58) laurinsyre; (66) myristinsyre; (67) heksahydrofarnesylacon; (70) palmitinsyre; (73) linolensyre.

det høje indhold af fedtsyrer er tidligere fundet i E. stricta EO (25,7% i alt) også med den højeste andel palmitinsyre (20,3%) og myristinsyre (3,9%) . Der er imidlertid ingen anden forbindelse til stede i betydelig mængde, der ville indikere sammenhængen mellem disse to Euphrasia-arter.

3.2. Antimikrobiel aktivitet

E. rostkoviana EO viste aktivitet mod seks ud af syv organismer testet med mikrofoner, der spænder fra 512 til 2048 liter/mL. De Gram-positive bakterier var mere følsomme end de Gram-negative og gæren, mens P. aeruginosa var den eneste organisme, der ikke blev hæmmet af olien i de højeste testede koncentrationer. EO ‘s Mikrofoner, MBCs og MFC’ er mod alle testede mikroorganismer er opsummeret i tabel 2. De aktive koncentrationer er sammenlignelige med dem, der tidligere er rapporteret for for eksempel EOS af Artemisia annua, Eucalyptus globulus, Mentha suaveolens, Myrtus communis, Ocimum basilicum eller Thymus vulgaris, især i tilfælde af anticandidal aktivitet . Olien var også mere effektiv end E. rostkoviana ekstrakter testet af Teikseira og Silva mod E. coli, E. faecalis, S. aureus og S. epidermidis. Referenceantibiotikas Mikrofoner mod bakterier og gær, der er modtagelige for E. rostkoviana EO var i overensstemmelse med CLSI ‘ s acceptable grænser og tidligere rapporter .

Microorganism Euphrasia rostkoviana EO CIP TIO MIC (µg/mL) IC50 (µg/mL) MBC/MFC (µg/mL) MIC (µg/mL) MIC (µg/mL) 24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 24 h 48 h Enterococcus faecalis 512 — 128 — 1024 0.5 — Staphylococcus aureus 512 — 128 — >2048 0.5 — Staphylococcus epidermidis 512 — 256 — >2048 0.25 — Klebsiella pneumoniae 2048 — 1024 — >2048 0.125 — Escherichia coli 2048 — 1024 — >2048 0.015 — Pseudomonas aeruginosa >2048 — >2048 — >2048 0.125 — Candida albicans 128 1024 128 1024 2048 — 0.063

The growth inhibition was measured after 24 h and 48 h of incubation in case of C. albicans; EO: essential oil; CIP: ciprofloxacin; TIO: tioconazole; MIC: minimum inhibitory concentration; IC50: inhibitory concentration causing ≥50% of bacterial growth; MBC: minimum bactericidal concentration; MFC: minimum fungicidal concentration.

Table 2

The inhibitory and cidal concentrations of E. rostkoviana essential oil.

da indholdet af den vigtigste eo-bestanddel palmitinsyre ikke overstiger 20%, og der er mere end 10 andre antimikrobielle aktive forbindelser i området fra 1 til 8%, er det vanskeligt at foreslå de vigtigste midler, der er ansvarlige for E. rostkoviana EO antimikrobielle virkning. Palmitinsyre er tidligere blevet identificeret som den største forbindelse af fraktioner, der er aktive mod Gram-negative, men ikke Gram-positive bakterier . På den anden side er mediumkædede mættede fedtsyrer og langkædede umættede fedtsyrer kendt for at hæmme især Gram-positive bakterier . Desuden udøver laurinsyre også aktivitet mod en række svampe . Således skyldes den antimikrobielle aktivitet af EO sandsynligvis en kompleks virkning af de antimikrobielle fedtsyrer med de andre velkendte antimikrobielle forbindelser, der er identificeret i EO, såsom anethol, borneol, kamfer, carvacrol, linalool, menthol, purpurterpineol eller thymol.

4. Konklusioner

Som konklusion afslørede den kemiske analyse en række antimikrobielle aktive stoffer, der var til stede i E. rostkoviana EO og dets antifungale og antibakterielle aktivitet mod Gram-positive såvel som Gram-negative bakterier blev bekræftet. Så vidt vi ved, er dette den første rapport om sammensætningen og den antimikrobielle aktivitet af E. rostkoviana EO.

interessekonflikt

forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt vedrørende offentliggørelsen af dette papir.

anerkendelser

dette arbejde blev økonomisk støttet af European Science Foundation og Ministeriet for Uddannelse, Ungdom og sport i Tjekkiet projekt TS.1.07/2.3.00/30.0040; af S-bevillingen fra Ministeriet for Uddannelse, Ungdom og sport i Tjekkiet; og af det tjekkiske Universitet for biovidenskab Prag projekt IGA 20155012. Forfatterne er taknemmelige for Slavka Barlakova for engelsk korrekturlæsning.