Hvad er forskellen mellem en sydlig, nordlig og vestlig Blot?

forskellige blottingsteknikker anvendes til at identificere unikke proteiner og nukleinsyresekvenser. Sydlige, nordlige og vestlige blot-protokoller er ens og begynder med elektroforetisk adskillelse af protein-og nukleinsyrefragmenter på en gel, som derefter overføres til en membran (nitrocellulosemembran, polyvinylidendifluorid (PVDF) membran osv.) hvor de er immobiliserede. Dette gør det muligt for radioaktivt mærkede eller DNA-prober at binde det immobiliserede mål, og molekylerne af interesse kan derefter visualiseres med forskellige metoder. Blottingsteknikker vælges ud fra målmolekylet: DNA, RNA eller protein. (Figur 1, Tabel 1).

Southern Blot

Southern blots bruges til at bestemme identitet, størrelse og overflod af specifikke DNA-sekvenser. Southern blot-protokollen begynder med DNA-ekstraktion fra cellerne eller vævene, som derefter fordøjes for at producere DNA-fragmenter. Fragmenterne adskilles efter størrelse på en agarose-eller polyacrylamidgel via elektroforese. Mindre fragmenter migrerer længere på gelen end større. Efter elektroforese overføres DNA ‘ et på gelen til en nylonmembran. Membranen inkuberes med en nukleinsyresonde, der har en sekvens, der er homolog med målsekvensen og er mærket med radioaktivitet, fluorescerende farvestof eller et ferment, der er i stand til at generere et kemiluminescerende signal. Hybridisering af komplementære sekvenser forekommer under inkubation, og den uhybridiserede sonde fjernes ved vask med buffer. De fuldt hybridiserede mærkede probemolekyler forbliver bundet til blot. Detektionsmetoder er forskellige baseret på sondeetiketten; radiomærkede prober visualiseres med røntgenfilm eller fosforimaging, og ensymatisk mærkede prober visualiseres med kemiluminescerende substrat.

Southern blot protocol

1. DNA-isolering
2. restriktion fordøjelse: fordøj DNA ‘ et med en restriktion, og koncentrer om nødvendigt fordøjet DNA.
3. gelelektroforese: Forbered en agarosegel og enten TAE-eller TBE-buffer (buffervalg afhænger af varigheden af løbet og størrelsen på DNA-fragmenterne). Indlæs prøver i brønde og inkluder en DNA-molekylvægtsmarkør. Kør gelen.
4. overførsel:
   • anbring gelen i en beholder med denatureringsopløsning, og vask to gange i 15 minutter på en ryster.
   • skyl med vand, vask derefter med neutraliseringsopløsning.
   • i løbet af det foregående trin skal du begynde at forberede tegnepapir og nylonmembran til overførslen.
   • Saml overførselsapparatet med membranen, papirpapir og gel og overfør i SSC eller SSPE buffer.
   • når overførslen er afsluttet, skal du tværbinde DNA i en tværbinder og derefter skylle membranen.
5. Pre-hybridisering (blokering):
   • blokering reducerer ikke-specifik binding til membranen. Forbered præhybridiseringsopløsningen, og tilføj prøve-DNA. Fjern blot fra cross-linker, tilføje pre-hybridisering løsning og inkubere.
6. hybridisering:
   • Forbered sondeblandingen (en komplementær DNA-streng) og buffer.
   • Fjern præhybridiseringsopløsningen, og inkuber pletten med sonden (inkubationstiderne varierer afhængigt af applikationen).
   • efter inkubation udføres en vask med lav strenghed efterfulgt af en vask med høj strenghed for at forfine DNA ‘ et.
7. Sondedetektion:
   • skyl membranen, overfør den til en beholder med blokeringsopløsning og inkuber.
   • Fjern blokeringsopløsningen, Erstat med antistofopløsning og inkuber.
   • kasser antistofopløsningen, vask membranen.
8. Følg producentens anvisninger for detektion af kemiluminescerende stoffer.

Northern Blot

Northern blots bruges til at bestemme identitet, størrelse og overflod af specifikke RNA-sekvenser. Northern blot-protokoller begynder med RNA-isolering, og separationsteknikker varierer afhængigt af RNA-størrelse. Store RNA ‘ er adskilles ved elektroforese på en formaldehydagarosegel eller glyoksal agarosegel, som forhindrer normal baseparing og opretholder RNA i en denatureret tilstand. Små RNA ‘ er adskilles på en denaturerende (urinstof) polyacrylamidgel. RNA overføres derefter fra gelen til en nylonmembran, som derefter inkuberes med en radioaktivt eller ikke-isotopisk mærket RNA, DNA eller oligodeoksynukleotidprobe. Den uhybridiserede sonde fjernes ved vask med buffer. Radiomærkede prober visualiseres med røntgenfilm, og ensymatisk mærkede prober visualiseres med kemiluminescens.

Northern blot protocol

1. RNA-isolering
2. elektroforese:
   • for en formaldehydagarosegel: forbered gelen og indsæt gelbakken i apparatet. Fyld med MOPS buffer, indlæse prøverne og omfatte en molekylvægt markør. Kør gelen, og trim derefter gelen inden blotting.
   • for en glyoksal agarosegel: klargør gelen og indsæt gelbakken i apparatet. Fyld med MOPS buffer, forberede prøver og belastning i brønde sammen med RNA stigen.
   • til denaturering af polyacrylamidgel: kast gelen og monter den i elektroforeseenheden. Forbered prøver, indlæse i gelen, og køre med TBE kører buffer.
3. overførsel:
   • til en formaldehydagarosegel eller glyoksal agarosegel: vask gelen i SSC, saml derefter overførselsenheden med gelen, filterpapiret og nylonmembranen. Når overførslen er færdig, skal du placere membranen i en UV-tværbinder.
   • til denaturering af polyacrylamidgel: Saml overførselsenheden inklusive gel, filterpapir og nylonmembran, så de oversvømmes med tbe. Når overførslen er afsluttet, skal du placere membranen i en UV-tværbinder for at fastgøre RNA ‘ et til membranen.
4. Pre-hybridisering (blokering):
   • pre-hybridisere membranen i hybridiseringsopløsning.
5. hybridisering:
   • Tilføj sonde til hybridiseringsopløsningen og inkuber.
   • vask membranen i vask med lav strenghed for at fjerne hybridiseringsopløsning og uhybridiseret sonde og vask med høj strenghed for at fjerne delvist hybridiserede molekyler.
   • Følg producentens anvisninger for detektion af kemiluminescerende stoffer.

vestlig Blot

vestlige blots bruges til at bestemme identitet, størrelse og overflod af specifikke proteiner i en prøve. Den vestlige blot-protokol begynder med prøvelysatpræparat fra vævs-eller cellekultur og adskillelse på en polyacrylamidgel via elektroforese. De adskilte proteiner overføres derefter til en nitrocellulose-eller polyvinylidendifluorid (PVDF) membran. Membranen inkuberes med et blokeringsmiddel for at forhindre uspecifik binding efterfulgt af inkubation med et primært antistof til at binde proteinet af interesse. Der er to detektionsmetoder, direkte og indirekte. Direkte detektion (figur 2) er afhængig af et mærket primært antistof, hvorimod indirekte detektion kræver et primært antistof rettet mod målproteinet og et sekundært antistof rettet mod immunoglobinklassen eller underklassen af det primære antistofs Art (figur 3). Visualiseringsmetoder inkluderer kolorimetriske analyser, hvor der produceres et farvet bundfald, kemiluminescens og fluorescens.

vestlig blot-protokol

1. Forbered lysat fra cellekultur eller væv.
2. prøveforberedelse:
   • Bestem proteinkoncentrationen af hver prøve med et proteinkvantificeringsassay (dvs. Bradford assay).
   • Tilføj et lige volumen på 2 gange Laemmli-prøvebuffer til hver prøve.
   • nogle prøver skal muligvis reduceres eller denatureres, dette opnås ved kogning af prøver i buffer.
3. elektroforese:
   • Forbered en SDS-side gel, Indlæs prøver sammen med molekylvægtmarkør.
   • Kør gelen i kørende buffer.
4. overførsel:
   • efter elektroforese samles overførselsenheden inklusive gel -, PVDF-eller nitrocellulosemembranen og filterpapir.
   • Overfør proteinerne til membranen med overførselsbuffer.
5. Antistoffarvning (indirekte detektion):
   • Forbered blokerende buffer og inkuber membranen for at reducere ikke-specifik binding.
   • inkuber membranen med primært antistof fortyndet i blokerende buffer.
   • vask membranen i TBST og inkuber med konjugeret sekundært antistof fortyndet i blokerende buffer.
   • vask membranen i TBST.
   • Følg producentens anvisninger for detektion af kemiluminescerende stoffer.