4.2.1 Polymerase II

selvom transkriptionsterminering er blevet meget mindre udforsket end dens initiering, har de sidste 25 år afsløret, at den godt tidsbestemte og nøjagtige frigivelse af det spirende transkript og RNA-polymeraser fra DNA-skabelonen er afgørende for RNA ‘ s skæbne såvel som for den samlede genomvedligeholdelse.

senere arbejde afslørede, at Rat1 i gær og Hrn2 hos mennesker var ansvarlige for torpedoaktiviteten, og at manglen på enten f.eks. Det er også muligt, at en plante Rat1 homolog, Arabidopsis Atksrn3, fungerer som en transkriptionstermineringsfaktor svarende til Rat1/Hrn2. High-throughput tilgange afslørede en ophobning af ikke-kodende udskrifter fra 3′-enden af mRNA og microRNA (miRNA) gener i hrn3 nedslagsmutant, hvilket kan svare til transkriptionelle gennemlæsningsmolekyler . Atcrn3 kan således deltage i en global RNA 3′-end overvågning som følge af dens torpedo termineringsaktivitet.

torpedomekanismen afhænger af den eksonukleasekatalytiske aktivitet af Rat1 og ikke kun af dens tilstedeværelse . Det monophosphorylerede RNA-substrat for Rat1 / Hrn2 under mRNA-syntese genereres som et resultat af en cotranscriptional spaltning (CoTC) på polyadenyleringsstedet ved hjælp af mRNA 3′ – end-dannelsesmaskineriet. Mere præcist udføres denne proces af Ysh1-komponenten af CF II i gær eller den tilsvarende CPSF-73-underenhed af den humane spaltnings-og polyadenyleringsspecifikitetsfaktor (CPSF) (gennemgået i Ref. ). To faktorer blev foreslået for at bidrage til effektiv opsigelse: styrken af poly(A) – signalet og virkningen af eksonukleasen, der nedbryder 5′ – spaltningsproduktet, hvilket letter pause af polymerasen nedstrøms for poly (A) – stedet og fremmer dets frigivelse . På den anden side afskaffer nedsat Rat1-afhængig opsigelse ikke korrekt anerkendelse af Poly(a)-sted og mRNA-spaltning .

yderligere Rat1 / Hrn2-indgangssteder kan opstå gennem autokatalytisk CoTC nedstrøms for poly(A) – stedet hos pattedyr eller Endonukleolytisk spaltning med Rnt1 i gær . Sidstnævnte tilfælde blev rapporteret som en fejlsikker termineringsmekanisme for proteinkodende gener, som sammen med vejen medieret af nrd1/Nab3/Sen1-komplekset (NRD) giver en backup-tilstand til Pol II-frigivelse.selvom Rat1 / RN2 er påkrævet for effektiv pol II-afslutning, udløser Rat1 ikke ophør in vitro, og dens 5′-3′ nedbrydningsaktivitet er ikke tilstrækkelig til at fremme polymerasedissociation in vivo. Konsekvent, gær Ksrn1 målrettet mod kernen er i stand til cotranscriptional nedbrydning af spirende RNA, men redder ikke termineringsfejl forårsaget af en Rat1-mangel. Disse observationer antyder, at eksonukleasen, der indhenter polymerasen, er nødvendig, men ikke tilstrækkelig til at destabilisere forlængelseskomplekset, og at et yderligere element i torpedomekanismen fungerer under afslutning. Det er blevet postuleret, at en Rat1-unik funktion, det udvidede tårndomæne, der ikke findes i hrn1-proteiner, kan være ansvarlig for dets termineringsegenskaber . Det kan tænkes, at tårndomænet gennemgår visse ændringer eller fungerer som en grænseflade til interaktioner med termineringsforbedrende faktorer. En af de mulige kandidater til faktorer, der stimulerer Rat1-afhængig opsigelse, er RNA helicase Sen1, som er en nøglekomponent i termineringsvejen for ikke-kodende RNA ‘er i gær (se nedenfor), der også bidrager til ophør af proteinkodende gener med den stærkeste effekt på kortere mRNA’ er . Sen1 interagerer via Sit N-terminale domæne med den største Pol II-underenhed, Rpb1 og nedsat sen1-helikaseaktivitet forringer Pol II-distributionen over hele genomet over kodende og ikke-kodende gener . Den humane sen1-homolog, Senataksin, viste sig direkte at fremme den 2-medierede transkriptionsterminering ved at løse RNA:DNA-hybrider (R-sløjfer) dannet bag den forlængede Pol II, overvejende ved G-rige pausesteder nedstrøms for poly(a) – stedet . Denne aktivitet letter adgangen for Hrn2 til poly (a) site 3′ spaltningsprodukter og bidrager således til rekruttering af torpedoeksonuklease. Virkemåden for gær Sen1 menes at være ens .

et ubesvaret spørgsmål er, hvordan Rat1 rekrutteres til den langstrakte polymerase. Flere observationer understøtter Rat1-tilknytning via proteiner, der interagerer med Pol II C-terminal domæne (CTD) gennem deres CTD-interagerende domæne (CID), nemlig Pcf11-underenheden af gærspaltningsfaktoren IA (CFIA) og Rtt103 (regulator for Ty1-transposition 103). Rat1 og Rai1 er til stede ved promotorer og kodende regioner med en stærk berigelse ved 3′-enderne af gener. Den funktionelle interaktion mellem Rat1 og Pcf11 blev vist at lette den gensidige corecruitment af begge faktorer: Rat1 forbinder opsigelse til 3′-end-dannelsen ved at stimulere rekrutteringen af 3′ – end behandlingsfaktorer, især CFIA-underenhederne Pcf11 og Rna15, mens Pcf11 bidrager til Rat1-tilknytning over poly(a) – stedet . Også human Pcf11 blev vist at forbedre nedbrydning af spirende RNA og fremme transkriptionsterminering . Til gengæld kopierer Rtt103, som også forbinder nær 3′-enderne af gener, med Rat1, Rai1 og Pcf11, og sammen med Pcf11 genkender kooperativt den Ser2-phosphorylerede CTD af den forlængende Pol II . På den anden side ændres Rat1-fordeling over gener ikke i fravær af Rtt103 . Derudover afslutter Rat1 også transkription med Pol i, som mangler en CTD, hvilket antyder, at Rat1-rekruttering også kan forekomme via andre mekanismer. Faktisk blev associeringen af hksrn2 rapporteret at være medieret af p54nrb/PFS (proteinassocieret splejsningsfaktor), som er multifunktionelle proteiner involveret i transkription, splejsning og polyadenylering . Rollen af p54nrb / PFS i Pol II transkriptionsterminering blev også demonstreret i C. elegans.

ud over mRNA ‘er syntetiserer Pol II en bred vifte af ikke-kodende udskrifter, herunder små nukleare RNA’ er og snorna ‘er og en række ustabile RNA’ er. I gær afsluttes transkriptionen af disse relativt korte arter hovedsageligt af et alternativt NRD-kompleks, der består af de RNA-bindende proteiner Nrd1 og Nab3 og den ATP-afhængige helicase Sen1 . Da denne mekanisme sandsynligvis ikke medfører en cotranscriptionel endonukleolytisk spaltning, er det Sen1 RNA:DNA-hybridafviklingsaktivitet, der menes at være essentiel for polymerasedissociation, måske på en måde svarende til bakteriel Rho DNA–RNA-helikase. Rho destabiliserer sandsynligvis forlængelseskomplekset ved at translokere langs og fjerne det spirende RNA fra polymerasen . En alternativ allosterisk model antyder, at Rho indlæses på polymerase og inducerer omlejringer på det aktive sted på termineringssteder . Begge handlingsmåder kan godt ansøge om Sen1 helicase.

selvom Rat1 rekrutteres til snoRNA-gener, især introniske, er NRD-afhængig afslutning af snoRNA-udskrifter ikke forringet, når det mangler, og det blev derfor foreslået, at det deltager i nogle for tidlige termineringshændelser . Det er dog stadig muligt, at Rat1-torpedomekanismen kan bidrage til transkriptionsafslutning af snorna’er, såsom U3 eller snR40, hvis 3′-ende frigives ved rnt1-spaltning, der udsætter det resterende spirende transkript 5 ‘ – ende for Rat1-angreb .