cytopatisk virkning (CPE): hvordan kommer vira væk med mord

vira er per definition usynlige for vores øjne. De er nanostrukturer, der kun kan blive synlige ved hjælp af elektronmikroskopi, en teknik, der er tidskrævende og ikke tilgængelig for alle. Som en konsekvens skal en virolog finde alternativer for at kunne arbejde og studere sit objekt af interesse. En praktisk måde at” se ” og indirekte måle en virusinfektion er ved at se på den skade, en virus forårsager en celle. Denne lidelse eller skade er kendt som cytofatisk virkning (CPE), og dens måling anvendes i vid udstrækning i virologilaboratorier over hele verden.

CPE er en meget grundlæggende tilgang til at forstå, hvordan en virus inficerer en celle, men det betyder ikke, at den kun bruges i grundlæggende videnskabelig forskning. Måling af CPE ‘ er kan også være en meget nyttig udlæsning for farmaceutiske virksomheder og diagnostiske laboratorier.

Hvad er virusinduceret cytofatisk effekt?

vira er parasitter, der har brug for en værtscelle for at replikere. Når de er inde i cellen, kaprer de det cellulære maskineri for at producere sine egne proteiner, nukleinsyre og membran (når det er nødvendigt).

da virussen optager cellulære faktorer, der ellers bruges af cellen, kan dens replikation ændre værtscellernes grundlæggende funktioner eller endda ødelægge den. Sættet af celleændringer eller ændringer som følge af en virusinfektion er kendt som CPEs. Dette er normalt negative ændringer, der kan forårsage strukturelle, metaboliske eller funktionelle ændringer i den celle, der inficeres. Over tid kan CPE ‘ er give anledning til virusets patologiske virkninger (sygdommen).

klassiske eksempler på den cytopatiske virkning

en velkendt virusinduceret-CPE er celledød (tjek en video af en døende celle i ). Mange vira dræber celler enten ved lysis eller ved at inducere apoptose. For eksempel er HIV kendt for at dræbe CD4+ T-lymfocytter, hvilket er hovedårsagen til, at inficerede individer bliver immunkompromitterede.

i laboratoriet er en nem måde at dræbe en mygcellelinie (som C6 / 36) eller Vero-celler ved at inficere den med enhver berømt arbovirus, som Chikungunya, Dengue eller Jika. Efter et par dage med infektion cellerne bare falde fra hinanden lige foran dine øjne (Fig. 1).

Figur 1 | Vero-celler blev inficeret med Jika-virus. Efter 72 timers infektion er en klar CPE tydelig ved tilstedeværelsen af celledebri som følge af celledød.

et andet CPE-eksempel er syncytia-dannelse. Celler inficeret af indhyllede vira udtrykker virale proteiner på deres plasmamembran, som bruges af vira til at formidle fusion med værtscellen. Når disse virale proteiner binder til receptorer på overfladen af naboceller, finder cellecellefusion sted, hvilket resulterer i syncytiadannelse (multinucleated giant cell).

respiratorisk syncytialvirus (RSV) er den største årsag til viral lungebetændelse hos små børn. Dets navn stammer fra det faktum, at det kan danne syncytia i cellekultur, men bemærkelsesværdigt også i lungerne hos inficerede patienter.

CPE-relaterede ændringer i cellemorfologi inkluderer også afrunding, frigørelse og / eller sammenklumpning af klæbende celler. I dette tilfælde forbliver inficerede celler metabolisk aktive for at replikere virussen, men deres cytoskelet ændres. De morfologiske ændringer kan forklares ved en nedregulering af ekspressionen af overfladeadhæsionsproteiner som følge af infektion. Ebola-virus er for eksempel kendt for at forårsage dramatiske morfologiske ændringer i vedhængende celler ved at reducere ekspressionen af integrin kr1.

har du virkelig brug for så meget drama (død, gigantisme, deformation) for at det kan betragtes som en CPE? Ingen. Celler kan bare “opføre sig” anderledes, når de smittes, men ser ens ud. Mere subtil, men stadig klar CPE-type ændringer kan omfatte ændring af væksthastighed/kinetik, ændringer i en given metabolisk aktivitet eller ændringer i cellefunktion. Blandt de forskellige vira, der kan inducere disse typer af CPEs står Jika virus. I 2015 var denne mygoverførte virus overalt i nyhederne, fordi den forårsager mikrocefali, en alvorlig neurologisk skade, der er kendetegnet ved en reduceret hjernestørrelse hos fostre. Senere blev det beskrevet, at mikrocefali er resultatet af flere Cytopatiske virkninger på neurale celler, herunder cellehypertrofi, vækstbegrænsning, cellecyklusdysregulering og celledød. En kolonidannelsesanalyse blev for eksempel brugt til at identificere, hvilke af de forskellige Jika-proteiner, der interfererer med celleproliferation.

for forskere, der systematisk sammenligner cellernes vækstkinetik, anbefaler vi CytoSMART omni. Kinetisk levende celle billeddannelse af hele brønde, ved hjælp af automatiseret scanning og billede syning programmel. Billede fuld godt plader i timer til uger ad gangen.

Cytopatiske virkninger er resultatet af virus-værtsinteraktioner

det er vigtigt at nævne, at CPE ikke kun er defineret af virussen, men også af værtscellen. Det afhænger af, hvor permissive cellerne er for infektion. At være en permissiv celle, en der kan understøtte væksten af en virus. Med andre ord kan ikke alle vira inficere alle celletyper. For at holde det enkelt kan vi sige, at:

• ikke permissiv cellevirus kan ikke inficere
• permissiv cellevirus kan replikere, men forårsager ikke åbenlyst CPE
• meget permissiv cellevirus replikerer og inducerer en åbenbar CPE

så hvis du tilføjer virus til dine celler, og der ikke sker noget, skal du ikke bekymre dig. Du skal bare finde den rigtige virus-celle kombination.

udlæsninger-hvordan måles CPE?

Virusinducerede cellulære ændringer som celledød eller en ændret morfologi er synlige ved lysmikroskopi. Du kan bare lægge din plade under et standard omvendt mikroskop og se om dine celler døde eller på en eller anden måde ændrede sig. Et positivt aspekt ved denne tilgang er, at det er “let”, fordi det ikke kræver nogen behandling af prøven, hvilket undgår fiksering eller farvning af artefakter.

på ulempen er det kvalitativt og ikke kvantitativt, og det er stærkt afhængig af observatørens træning. I dag kan denne tilgang automatiseres ved at udføre realtidsovervågning af virusinduceret cytopatogenese. For eksempel kan virusændringer af cellespredning og proliferation vurderes gennem et sårhelingsassay, hvor reduceret kollektiv og enkeltcellemigrationshastighed kan detekteres sammen med alvorlige ændringer i cellemorfologi. En anden kvantitativ tilgang er overvågning af celleproliferation ved automatiseret billedanalyse. Med denne teknologi er det muligt at generere vækstkurver af inficerede vs. ikke-inficerede cellekulturer til korrekt kvantificering af den cytopatiske virkning, som en virusinfektion kan have.

hvis dødsceller er det, der gør din dag, er et alternativ det berømte Plakassay. Denne klassiske virologiteknik bruges til at kvantificere infektiøse virale partikler, og den er baseret på princippet om, at vira kan inducere cellelyse. Efter at have inficeret et monolag af stærkt tilladte celler, er cellerne modfarvet med krystalviolet (levende celler er farvede, dødsceller forbliver ufarvede), hvilket resulterer i smukke plaketter (områder af dødsceller), der let kan kvantificeres med det blotte øje.

men du behøver ikke at se dine celler for at vide, at de er død. Cellelevedygtighed efter infektion kan måles ved at kvantificere intracellulær ATP-koncentration med firefly luciferase eller med det traditionelle MTT-assay.

at arbejde med vira kan være besværligt, BSL-3/4 laboratorier har strenge sikkerhedsforanstaltninger, og det tager meget tid at komme ind og ud af laboratoriet. For forskere, der leder efter en løsning til at overvåge deres celler uden at skulle komme ind i laboratoriet, anbefaler vi at se på CytoSMART Luksus2 Duo Kit.

applikationer

er din virus inducerende en CPE? Kan du tydeligt se eller måle det? Fedt! Du kan bruge denne CPE som udlæsning af en vellykket virusinfektion eller replikation. En given CPE kan tjene som en indikator for at finde ud af, hvordan man forhindrer en infektion, at karakterisere vært-eller patogenfaktorer, der kræves for at en infektion kan finde sted, for at identificere virustropisme, blandt andre. I praksis betyder det, at det kan bruges som udlæsning til:

• Screening og evaluering af antiviral forbindelse
  kan en lægemiddelkandidat forhindre CPE-dannelse?
• Screening for neutraliserende antistoffer
  kan et givet antistof hæmme virusinduceret CPE?
• overvågning af antiviral lægemiddelresistens (fænotypebestemmelse)
  kan et givet virusisolat inducere CPE i nærvær af antivirale lægemidler?
• karakterisering af virustropisme
  hvilke celletyper er fortrinsvis inficeret af en virus? Hvorfor? (Tjek en nylig publikation med den berygtede SARS-CoV-2 i .)
• diagnose af virussygdomme
  er en virus aktivt inficerer en person? Er den kliniske prøve indsamlet fra den person, der inducerer CPE? Lad os huske på, at de fleste diagnostiske metoder (ELISA, RT-kpcr) ikke registrerer infektiøse virale partikler.

for at konkludere…

selvom der er flere måder at måle virusinfektion på, forbliver kontrol af CPE ‘ er i permissive celler som et meget anvendt alternativ. For at det skal være virkelig nyttigt, skal du finde den rigtige kombination: en virus, en permissiv celle og en nøjagtig aflæsning. Når du har fundet denne kombination, kan applikationerne være ganske forskellige og nyttige enten i akademiske omgivelser, i industrien eller i klinisk diagnostik.

Lær om alle CytoSMART imaging løsninger her