shRNA versus siRNA
RNA-Interferenz (RNAi) ist ein biologischer Prozess, bei dem RNA-Moleküle zur Hemmung der Genexpression verwendet werden. Typischerweise werden kurze RNA-Moleküle erzeugt, die komplementär zu endogener mRNA sind und, wenn sie in Zellen eingeführt werden, an die Ziel-mRNA binden. Die Bindung des kurzen RNA-Moleküls an die Ziel-mRNA inaktiviert die Ziel-mRNA funktionell und führt manchmal zu einem Abbau der Ziel-mRNA.
In der Vergangenheit wurden zwei Arten von kurzen RNA-Molekülen in RNAi-Anwendungen verwendet. Small Interfering RNA (siRNA) sind typischerweise doppelsträngige RNA-Moleküle mit einer Länge von 20-25 Nukleotiden. Bei der Transfektion in Zellen hemmt siRNA die Ziel-mRNA vorübergehend, bis sie auch innerhalb der Zelle abgebaut wird. Kleine Haarnadel-RNAs (shRNA) sind Sequenzen von RNA, typischerweise etwa 80 Basenpaare lang, die eine Region der internen Hybridisierung enthalten, die eine Haarnadelstruktur erzeugt. shRNA-Moleküle werden innerhalb der Zelle zu siRNA verarbeitet, die wiederum die Genexpression hemmt. Der Vorteil von shRNA besteht darin, dass sie in Plasmidvektoren eingebaut und in genomische DNA integriert werden können, um eine längerfristige oder stabile Expression und damit einen längeren Knockdown der Ziel-mRNA zu erreichen.
shRNA wird in der Zelle durch Exportin 5, Dicer und den RISC / AGO2-Komplex verarbeitet. Die lentivirale Abgabe der shRNA ermöglicht eine stabile Expression und einen dauerhaften Knockdown des Zielgens. (Bild von Dan Cojocari ✉*✍* [CC BY-SA 3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0) oder GFDL http://www.gnu.org/copyleft/fdl.html, via Wikimedia Commons)
Effektive Expression von shRNAs aus RNA-Polymerase-III-Promotoren
Kleine RNAs einschließlich shRNAs werden endogen mit RNA-Polymerase III (Pol III) transkribiert. Um eine hohe Expression von shRNAs zu gewährleisten, verwendet Cellecta daher Promotoren, die Pol III, die U6- und H1-Promotoren, spezifisch binden. Sowohl die U6- als auch die H1-Promotoren arbeiten gut daran, hohe shRNA-Spiegel in vielen Zelltypen zu exprimieren, verglichen mit Pol-II-Promotoren wie CMV und EF1, die shRNAs aufgrund ihrer geringen Größe nicht so effektiv exprimieren. Darüber hinaus funktionieren Pol-II-Promotoren, die zur Expression von shMIRs verwendet werden, möglicherweise nicht in den meisten Zelltypen, in denen U6 und H1 gut funktionieren.
Lentivirale Vektoren ermöglichen permanenten Knockdown von Zielen
Die shRNA wird stabil in das Wirtszellengenom integriert. Wenn sich Zellen teilen, wird die shRNA an Tochterzellen weitergegeben. Die Verwendung von lentiviralen Vektoren zur Expression von shRNAs ermöglicht einen dauerhaften Knockdown, ohne dass die Zellen mehrmals transfiziert werden müssen. Weitere Informationen zur Funktionsweise lentiviraler Vektoren finden Sie auf unserer Seite lentivirales Vektorsystem.
Optimierung des shRNA-Designs
Das Design effektiver shRNAs ist für ein effektives RNAi-Knockdown-Screening unerlässlich. Neben der Auswahl der optimalen Sequenz gibt es eine Reihe struktureller Faktoren, die die Wirksamkeit von shRNA beeinflussen. Darüber hinaus stellt die Stem-Loop-Haarnadelstruktur von shRNA Probleme für den Bibliotheksbau und die Amplifikation dar. Um repräsentative Qualität shRNA Bibliotheken zu erstellen, haben wir erhebliche Anstrengungen konzentriert wirksam der shRNA Einsätze in unseren Bibliotheken zu optimieren. Wir haben einen internen Algorithmus entwickelt, um die effektivsten shRNA-Sequenzen vorherzusagen, und kombinieren dies mit veröffentlichten Daten validierter Sequenzen beim Aufbau unserer Bibliotheken. Wir haben auch die Struktur von shRNA für den Bibliotheksbau optimiert.
Um shRNA-Strukturvariationen in großem Maßstab effizient zu testen, haben wir eine Hochdurchsatz-shRNA-Wirksamkeitstesttechnologie entwickelt, die auf einem Reporterassay basiert. Es wurde zuvor gezeigt, dass ein Reportergen (wie GFP) mit einer 3′-Fusion zu einem cDNA-Fragment oder kurzen Oligonukleotid aus einem Zielgen effektiv verwendet werden könnte, um die Wirksamkeit von siRNA- und shRNA-Konstrukten gegen dieses Zielgen zu überwachen. Basierend auf diesen Erkenntnissen entwickelten wir einen lentiviralen Reportervektor zur Identifizierung funktioneller shRNA-Konstrukte (Abbildung 1). Unser proprietärer shRNA-Testreportervektor ermöglicht die Klonierung sowohl der shRNA-Vorlage stromabwärts des H1-Promotors als auch der Zielsequenzen am 3′-Ende des GFP-Reporters. Wenn dieses Konstrukt in Zellen transduziert wird, erzeugt die Transkription vom H1-Promotor shRNA, während die Transkription vom CMV-Promotor ein GFP-Sense-Ziel-mRNA-Fusionstranskript erzeugt, das als Reporter für das Screening funktioneller shRNAs verwendet werden kann.
Karte des in die genomische DNA integrierten lentiviralen shRNA-Zielreporterkonstrukts und Mechanismus des Knockdowns des GFP-Zielreporters. Die mit funktionellen shRNA-Konstrukten transduzierten Zellen weisen niedrige GFP-mRNA-Spiegel auf, während nicht funktionelle shRNAs ein hohes Maß an GFP-mRNA-Expression ermöglichen.
Um die Struktur der shRNA zu optimieren, konstruierten wir eine shRNA-Target-Bibliothek im shRNA-Validierungsvektor für 150 shRNAs, wobei jede shRNA in 40 verschiedenen in der Literatur beschriebenen Designs konstruiert wurde.
Wir führten RNAi-Screens in CHO-TRex-Zellen durch, die mit dieser 150×40-barcodierten shRNA-Target-Bibliothek transduziert wurden, und maßen die Darstellung (in der Bibliothek und den transduzierten Zellen) und die Knockdown-Effizienz jedes shRNA-Konstrukts. Einige repräsentative Daten aus diesem Screening sind unten aufgeführt.
Die zehn besten Designs wurden auf der Grundlage derjenigen ausgewählt, die die höchste Ziel-Knockdown-Aktivität, die gleiche Amplifikationseffizienz von gepoolten Oligonukleotiden desselben Designs und die gleiche Darstellung shRNAs in den gepoolten RNAi-Bibliotheken. Die Knockdown-Effizienz von drei p53-shRNAs, die mit diesen 10 besten Designs in einem lentiviralen Vektor konstruiert wurden, wurde durch RT-PCR nach Transduktion in Mausfibroblastenzellen weiter analysiert.