Was ist der Unterschied zwischen einem südlichen, nördlichen und westlichen Blot?

Verschiedene Blotting-Techniken werden verwendet, um einzigartige Proteine und Nukleinsäuresequenzen zu identifizieren. Die Protokolle Southern, Northern und Western Blot sind ähnlich und beginnen mit der elektrophoretischen Trennung von Protein- und Nukleinsäurefragmenten auf einem Gel, die dann auf eine Membran (Nitrozellulosemembran, Polyvinylidendifluorid (PVDF) -Membran usw.) übertragen werden.), wo sie immobilisiert sind. Dies ermöglicht es radioaktiv markierten oder enzymatisch markierten Antikörper- oder DNA-Sonden, das immobilisierte Ziel zu binden, und die interessierenden Moleküle können dann mit verschiedenen Methoden visualisiert werden. Blotting-Techniken werden basierend auf dem Zielmolekül ausgewählt: DNA, RNA oder Protein. (Abbildung 1, Tabelle 1).

Southern Blot

Southern Blots werden verwendet, um die Identität, Größe und Häufigkeit spezifischer DNA-Sequenzen zu bestimmen. Das Southern-Blot-Protokoll beginnt mit der DNA-Extraktion aus den Zellen oder Geweben, die dann enzymatisch verdaut wird, um DNA-Fragmente herzustellen. Die Fragmente werden auf einem Agarose- oder Polyacrylamidgel durch Elektrophorese nach Größe getrennt. Kleinere Fragmente wandern weiter auf dem Gel als größere. Nach der Elektrophorese wird die DNA auf dem Gel auf eine Nylonmembran übertragen. Die Membran wird mit einer Nukleinsäuresonde inkubiert, die eine zur Zielsequenz homologe Sequenz aufweist und mit Radioaktivität, Fluoreszenzfarbstoff oder einem Enzym markiert ist, das in der Lage ist, ein Chemilumineszenzsignal zu erzeugen. Die Hybridisierung komplementärer Sequenzen erfolgt während der Inkubation, und die unhybridisierte Sonde wird durch Waschen mit Puffer entfernt. Die vollständig hybridisierten markierten Sondenmoleküle bleiben an den Blot gebunden. Die Nachweismethoden unterscheiden sich je nach Sondenetikett; radioaktiv markierte Sonden werden mit Röntgenfilm oder Phosphorimaging visualisiert, und enzymatisch markierte Sonden werden mit chemilumineszierendem Substrat visualisiert.

Southern Blot protocol

1. DNA-Isolierung
2. Restriktionsverdauung: Verdauen Sie die DNA mit einem Restriktionsenzym und konzentrieren Sie gegebenenfalls verdaute DNA.
3. Gelelektrophorese: Bereiten Sie ein Agarosegel und entweder TAE- oder FSME-Puffer vor (die Pufferauswahl hängt von der Dauer des Durchlaufs und der Größe der DNA-Fragmente ab). Laden Sie Proben in Vertiefungen und fügen Sie einen DNA-Molekulargewichtsmarker hinzu. Führen Sie das Gel.
4. Transfer:
   • Das Gel in einen Behälter mit denaturierender Lösung geben und zweimal 15 Minuten auf einem Schüttler waschen.
   • Mit Wasser abspülen, dann mit Neutralisationslösung waschen.
   • Bereiten Sie im vorherigen Schritt Whatman-Papier und Nylonmembran für die Übertragung vor.
   • Montieren Sie den Transferapparat mit der Membran, Whatman-Papier und Gel und transferieren Sie ihn in SSC- oder SSPE-Puffer.
   • Wenn die Übertragung abgeschlossen ist, vernetzen Sie die DNA in einem Vernetzer und spülen Sie dann die Membran aus.
5. Vorhybridisierung (Blockierung):Die
   • -Blockierung reduziert die unspezifische Bindung an die Membran. Bereiten Sie die Vorhybridisierungslösung vor und fügen Sie DNA-Probe hinzu. Entfernen Sie den Blot vom Vernetzer, fügen Sie die Vorhybridisierungslösung hinzu und inkubieren Sie.
6. Hybridisierung:
   • Sondenmischung (komplementärer DNA-Strang) und Puffer vorbereiten.
   • Entfernen Sie die Vorhybridisierungslösung und inkubieren Sie den Blot mit der Sonde (Inkubationszeiten variieren je nach Anwendung).
   • Führen Sie nach der Inkubation eine Wäsche mit niedriger Stringenz durch, gefolgt von einer Wäsche mit hoher Stringenz, um die DNA zu verfeinern.
7. Sondenerkennung:
   • Membran spülen, in einen Behälter mit Blockierlösung überführen und inkubieren.
   • Blockierungslösung verwerfen, durch Antikörperlösung ersetzen und inkubieren.
   • Antikörperlösung verwerfen, Membran waschen.
8. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für den Chemilumineszenznachweis.

Northern Blot

Northern Blots werden verwendet, um die Identität, Größe und Häufigkeit spezifischer RNA-Sequenzen zu bestimmen. Northern-Blot-Protokolle beginnen mit der RNA-Isolierung, und Trenntechniken variieren je nach RNA-Größe. Große RNAs werden durch Elektrophorese auf einem Formaldehyd-Agarosegel oder Glyoxal-Agarosegel getrennt, was eine normale Basenschälung verhindert und die RNA in einem denaturierten Zustand hält. Kleine RNAs werden auf einem denaturierenden (Harnstoff) Polyacrylamidgel abgetrennt. Die RNA wird dann vom Gel auf eine Nylonmembran übertragen, die dann mit einer radioaktiv oder nichtisotop markierten RNA-, DNA- oder Oligodesoxynukleotidsonde inkubiert wird. Die unhybridisierte Sonde wird durch Waschen mit Puffer entfernt. Radioaktiv markierte Sonden werden mit Röntgenfilm und enzymatisch markierte Sonden mit Chemilumineszenz visualisiert.

Northern Blot protocol

1. RNA-Isolierung
2. Elektrophorese:
   • Für ein Formaldehyd-Agarose-Gel: Bereiten Sie das Gel vor und setzen Sie die Gelschale in das Gerät ein. Füllen Sie mit MOPS-Puffer, laden Sie die Proben und fügen Sie einen Molekulargewichtsmarker hinzu. Führen Sie das Gel aus und schneiden Sie das Gel vor dem Abtupfen ab.
   • Für ein Glyoxal-Agarose-Gel: Bereiten Sie das Gel vor und setzen Sie die Gelschale in das Gerät ein. Füllen mit MOPS puffer, bereiten proben und last in brunnen zusammen mit RNA leiter.
   • Für ein denaturierendes Polyacrylamidgel: Gießen Sie das Gel und montieren Sie es in der Elektrophoreseeinheit. Proben vorbereiten, in das Gel laden und mit TBE-Laufpuffer laufen lassen.
3. Transfer:
   • Für ein Formaldehyd-Agarose-Gel oder Glyoxal-Agarose-Gel: Waschen Sie das Gel in SSC, dann montieren Sie die Transfereinheit mit dem Gel, Filterpapier und Nylonmembran. Wenn die Übertragung abgeschlossen ist, legen Sie die Membran in einen UV-Vernetzer.
   • Für ein denaturierendes Polyacrylamidgel: Montieren Sie die Transfereinheit einschließlich Gel, Filterpapier und Nylonmembran, um sicherzustellen, dass sie mit TBE geflutet sind. Wenn die Übertragung abgeschlossen ist, legen Sie die Membran in einen UV-Vernetzer, um die RNA an der Membran zu fixieren.
4. Vorhybridisierung (Blockierung):
   • Vorhybridisierung der Membran in Hybridisierungslösung.
5. Hybridisierung:
   • Sonde in die Hybridisierungslösung geben und inkubieren.
   • Waschen Sie die Membran in Waschungen mit niedriger Stringenz, um Hybridisierungslösung und unhybridisierte Sonde zu entfernen, und in Waschungen mit hoher Stringenz, um teilweise hybridisierte Moleküle zu entfernen.
   • Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Chemilumineszenz-Detektion.

Western Blot

Western Blots werden verwendet, um die Identität, Größe und Häufigkeit spezifischer Proteine innerhalb einer Probe zu bestimmen. Das Western-Blot-Protokoll beginnt mit der Probenaufbereitung von Lysat aus Gewebe- oder Zellkultur und der Trennung auf einem Polyacrylamidgel mittels Elektrophorese. Die abgetrennten Proteine werden dann auf eine Nitrozellulose- oder Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran übertragen. Die Membran wird mit einem Blockierungsmittel inkubiert, um eine unspezifische Bindung zu verhindern, gefolgt von einer Inkubation mit einem primären Antikörper, um das interessierende Protein zu binden. Es gibt zwei Nachweismethoden, direkte und indirekte. Der direkte Nachweis (Abbildung 2) beruht auf einem markierten Primärantikörper, während der indirekte Nachweis einen Primärantikörper gegen das Zielprotein und einen Sekundärantikörper gegen die Immunglobinklasse oder Unterklasse der Spezies des Primärantikörpers erfordert (Abbildung 3). Visualisierungsmethoden umfassen kolorimetrische Assays, bei denen ein farbiger Niederschlag erzeugt wird, Chemilumineszenz und Fluoreszenz.

Western Blot protocol

1. Lysat aus Zellkultur oder Gewebe herstellen.
2. Probenvorbereitung:
   • Bestimmen Sie die Proteinkonzentration jeder Probe mit einem Proteinquantifizierungstest (dh. In: Bradford assay).
   • Fügen Sie jeder Probe ein gleiches Volumen von 2X Laemmli-Probenpuffer hinzu.
   • Einige Proben müssen möglicherweise reduziert oder denaturiert werden.
3. Elektrophorese:
   • Ein SDS-PAGE-Gel vorbereiten, Proben zusammen mit Molekulargewichtsmarker laden.
   • Führen Sie das Gel im laufenden Puffer aus.
4. Transfer:
   • Montieren Sie nach der Elektrophorese die Transfereinheit einschließlich der Gel-, PVDF- oder Nitrozellulosemembran und des Filterpapiers.
   • Transferieren Sie die Proteine mit Transferpuffer auf die Membran.
5. Antikörperfärbung (indirekter Nachweis):
   • Blockierpuffer vorbereiten und die Membran inkubieren, um die unspezifische Bindung zu reduzieren.
   • Inkubieren Sie die Membran mit in Blockierpuffer verdünntem Primärantikörper.
   • Waschen Sie die Membran in TBST und inkubieren Sie mit konjugiertem Sekundärantikörper, verdünnt in Blockierpuffer.
   • Waschen Sie die Membran in TBST.
   • Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Chemilumineszenz-Detektion.