shRNA versus siRNA
RNA-interferenssi (RNAi) on biologinen prosessi, jossa RNA-molekyylejä käytetään estämään geenien ilmentymistä. Tyypillisesti syntyy lyhyitä RNA-molekyylejä, jotka täydentävät endogeenista mRNA: ta ja soluihin kulkeutuessaan sitoutuvat kohdehenkilöön mRNA: han. Lyhyen RNA-molekyylin sitoutuminen kohteeseen mRNA toiminnallisesti inaktivoi kohteen mRNA: ta ja johtaa joskus kohteen mRNA: n hajoamiseen.
historiallisesti RNAi-sovelluksissa on käytetty kahdenlaisia lyhyitä RNA-molekyylejä. Pienet häiritsevät RNA: t (siRNA) ovat tyypillisesti kaksijuosteisia RNA-molekyylejä, joiden pituus on 20-25 nukleotidia. Soluihin siirryttäessä siRNA inhiboi kohde-mRNA: ta ohimenevästi, kunnes ne hajoavat myös solun sisällä. Pienet hiusneulat Rnat (shRNA) ovat tyypillisesti noin 80 emäsparin pituisia RNA: n sekvenssejä, joihin kuuluu sisäisen hybridisaation alue, joka luo hiusneulan rakenteen. shRNA-molekyylit jalostuvat solun sisällä sirnaksi, joka puolestaan kaataa geeniekspression. Shrnan etuna on se, että ne voidaan liittää plasmidivektoreihin ja integroida genomiseen DNA: han pidempiaikaiseksi tai stabiiliksi ilmentymäksi ja siten pidemmäksi ajaksi kohde-mRNA: n tyrmäykseksi.
shrnaa käsitellään solussa Exportinin 5, Dicerin ja RISC / AGO2-kompleksin avulla. Shrna: n lentiviraalinen toimitus mahdollistaa kohdegeenin vakaan ilmentymisen ja pysyvän knockdownin. (Kuva: Dan Cojocari ✉ * ✍ * [CC BY-SA 3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0) tai GFDL http://www.gnu.org/copyleft/fdl.html Wikimedia Commons-sivuston kautta)
RNA polymeraasi III: n promoottoreiden Shrnojen efektiivinen ilmentyminen
Pienet RNA: t mukaan lukien shrnat transkriboidaan endogeenisesti RNA polymeraasi III: lla (Pol III). Tämä eroaa cdnoista, jotka transkriboidaan RNA polymeraasi II: lla. siksi cellecta käyttää promoottoreita, jotka sitovat erityisesti Pol III -, U6-ja H1-promoottoreita. Sekä U6 – että H1-promoottorit toimivat hyvin ilmaisemaan suuria shrnaacrossin tasoja monissa solutyypeissä verrattuna Pol II-promoottoreihin, kuten CMV ja EF1, jotka eivät ilmaise shrnoja yhtä tehokkaasti pienen kokonsa vuoksi. Lisäksi Shmiirien ilmaisemiseen käytettävät Pol II-promoottorit eivät välttämättä toimi useimmissa solutyypeissä, joissa U6 ja H1 toimivat hyvin.
Lentiviraaliset vektorit mahdollistavat kohteiden pysyvän Knockdownin
shRNA integroituu vakaasti isäntäsolun genomiin. Solujen jakautuessa shRNA siirtyy tytärsoluihin. Käyttämällä lentiviral vektoreita ilmaisuun shRNAs tarjoaa pysyvän knockdown tarvitsematta siirtää soluja useita kertoja. Lisätietoja lentiviral vektorit toimivat, katso meidän lentiviral vektori järjestelmä sivu.
Shrna-suunnittelun optimointi
tehokkaiden shrnojen suunnittelu on olennaista RNAi: n tehokkaassa knockdown-seulonnassa. Optimaalisen sekvenssin valitsemisen lisäksi on olemassa useita rakenteellisia tekijöitä, jotka vaikuttavat shrnan tehoon. Lisäksi shrnan kantasilmukkainen hiusneularakenne aiheuttaa ongelmia kirjaston rakentamiselle ja vahvistamiselle. Luodaksemme edustavia shrna-kirjastoja, olemme keskittäneet merkittäviä ponnistuksia optimoidaksemme shrna-inserttien tehokkuuden kirjastoissamme. Olemme kehittäneet sisäisen algoritmin, joka ennustaa tehokkaimmat shRNA-sekvenssit ja yhdistää tämän julkaistuihin tietoihin validoiduista sekvensseistä kirjastojamme rakennettaessa. Olemme myös optimoineet shrnan rakenteen kirjastorakentamista varten.
testataksemme tehokkaasti shRNA-rakenteen variaatioita laajamittaisesti kehitimme toimittajamääritykseen perustuvan suuritehoisen shrna-tehotestaustekniikan. Aiemmin osoitettiin, että toimittajageeni (kuten GFP), jossa on 3′ fuusio cDNA-fragmenttiin tai lyhyt oligonukleotidi kohdegeenistä, voitaisiin tehokkaasti käyttää siRNA-ja shRNA-konstruktioiden tehon seuraamiseen tätä kohdegeeniä vastaan. Näiden havaintojen perusteella kehitimme lentiviraalisen reporter-vektorin funktionaalisten shRNA-konstruktioiden tunnistamiseksi (Kuva 1). Meidän oma shRNA testaus reporter Vector mahdollistaa Kloonaus sekä shRNA mallin alavirtaan H1 promoottori ja kohdesekvenssejä 3 ’ lopussa GFP reporter. Kun tämä konstruktio transdukoidaan soluihin, transkriptio H1-promoottorista tuottaa shrnan, kun taas transkriptio CMV-promoottorista tuottaa GFP-sense target mRNA-fuusiotranskription, jota voidaan käyttää reportterina funktionaalisten shrnojen seulonnassa.
Map of shRNA-target lentiviral reporter construct integrated in genomic DNA and mechanism of knockdown of GFP-target reporter. Funktionaalisilla shRNA-konstruktioilla transdukoiduilla soluilla on alhainen GFP mRNA-taso, kun taas ei-funktionaaliset shrnat mahdollistavat korkean GFP mRNA-ilmentymän.
optimoidaksemme shrnan rakenteen rakensimme shrnan validointivektoriin shrna-kohdekirjaston 150 shrnalle, ja jokainen shRNA on rakennettu 40: llä kirjallisuudessa kuvatulla mallilla.
suoritimme RNAi-näyttöjä cho-TRex-soluissa, jotka transducoitiin tällä 150×40 viivakoodatulla shRNA-Kohdekirjastolla ja mitatulla esityksellä (kirjastossa ja transduced-soluissa) sekä jokaisen shRNA-Konstruktion knockdown-tehokkuudella. Seuraavassa esitetään joitakin edustavia tietoja tästä seulonnasta.
kymmenen parasta mallia valittiin niiden perusteella, joilla oli suurin kohde-knockdown-aktiivisuus, yhtä suuri vahvistustehokkuus saman mallin yhdistetyissä oligonukleotidit ja saman mallisten shrnojen yhtäläinen edustus yhdistetyissä RNAi-kirjastoissa. Kolmen p53-shrnan knockdown-hyötysuhde, joka on rakennettu näillä 10 parhaalla mallilla lentivektorissa, analysoitiin RT-PCR: llä sen jälkeen, kun se oli transduktioitu hiiren fibroblastisoluiksi.