Mitä eroa on eteläisellä, pohjoisella ja läntisellä blottauksella?

erilaisia blottaustekniikoita käytetään yksilöllisten proteiinien ja nukleiinihapposekvenssien tunnistamiseen. Eteläinen, pohjoinen ja läntinen blot protokollat ovat samanlaisia, ja alkaa elektroforeettinen erottaminen proteiinin ja nukleiinihapon fragmentteja geeli, jotka sitten siirretään kalvo (nitroselluloosakalvo, polyvinylideenidifluoridi (PVDF) kalvo, jne.), jossa ne ovat liikuntakyvyttömiä. Tämä mahdollistaa radioleimattujen tai entsymaattisesti merkittyjen vasta-aineiden tai DNA-koettimien sitomisen immobilisoituneeseen kohteeseen, ja kiinnostavia molekyylejä voidaan sitten visualisoida eri menetelmillä. Blottausmenetelmät valitaan kohdemolekyylin eli DNA: n, RNA: n tai proteiinin perusteella. (Kuva 1, Taulukko 1).

etelän Blottia

etelän blottia käytetään tiettyjen DNA-sekvenssien identiteetin, koon ja runsauden määrittämiseen. Eteläinen blot-protokolla alkaa DNA: n erottamisella soluista tai kudoksista, joka sitten pilkkoutuu entsymaattisesti DNA-fragmenttien tuottamiseksi. Fragmentit erotetaan koon mukaan agaroosi-tai polyakryyliamidigeelillä elektroforeesin avulla. Pienemmät palaset kulkeutuvat geelissä kauemmas kuin suuremmat. Elektroforeesin jälkeen geelin DNA siirretään nailonkalvolle. Kalvo inkuboidaan nukleiinihappoanturilla, jonka sekvenssi on homologinen kohdesekvenssin kanssa ja joka merkitään radioaktiivisuudella, fluoresoivalla väriaineella tai entsyymillä, joka kykenee tuottamaan kemiluminesenssisignaalin. Komplementtisekvenssien hybridisaatio tapahtuu inkubaation aikana, ja hybridoimaton luotain poistetaan pesemällä puskurilla. Täysin hybridisoituneet merkityt koemolekyylit pysyvät sitoutuneina täplään. Detektiomenetelmät vaihtelevat anturin etiketin perusteella; radioleimatut koettimet visualisoidaan Röntgenfilmillä tai fosforimagingilla ja entsymaattisesti merkityt koettimet visualisoidaan kemiluminesenssialustalla.

Southern blot protocol

1. DNA: n eristäminen
2. Restriktiodigestio: sulata DNA restriktioentsyymillä ja tarvittaessa konsentroida pilkottu DNA.
3. geelielektroforeesi: valmistetaan agaroosigeeli ja joko TAE-tai TBE-puskuri (puskurin valinta riippuu juoksun kestosta ja DNA-fragmenttien koosta). Ladataan näytteet kaivoihin ja sisällytetään DNA-molekyylipainomerkki. Tarkista geeli.
4. siirto:
   • aseta geeli denaturointiliuoksella varustettuun astiaan ja pese kahdesti 15 minuutin ajan ravistimella.
   • huuhtele vedellä ja pese sitten neutralisointiliuoksella.
   • edellisen vaiheen aikana aletaan valmistaa Whatman-paperia ja nailonkalvoa siirtoa varten.
   • kokoa siirtolaite kalvolla, Whatman-paperilla ja geelillä ja siirrä SSC-tai SSPE-puskurissa.
   • kun siirto on valmis, ristiinlinkitetään DNA ristiinlinkittyyn ja huuhdellaan sitten kalvo.
5. esikarsinta (esto:
   • esto vähentää epäspesifistä sitoutumista kalvoon. Valmistetaan hybridisaatiota edeltävä liuos ja lisätään dna-näyte. Poista täplä ristilinkistä, lisää esiristeytysliuos ja inkuboi.
6. hybridisaatio:
   • valmista koettimen seos (täydentävä DNA-juoste) ja puskuri.
   • Poista ennen hybridisaatiota syntynyt liuos ja inkuboi läikkä koettimella (inkubaatioajat vaihtelevat levityksestä riippuen).
   • inkubaation jälkeen suoritetaan matala-tiukkapesu, jota seuraa korkea-tiukkapesu DNA: n tarkentamiseksi.
7. koettimen toteaminen:
   • huuhdellaan kalvo, siirretään astiaan, jossa on estoliuos ja inkuboidaan.
   • hävitä estävä liuos, korvaa se vasta-aineliuoksella ja inkuboi.
   • hävitä vasta-aineliuos, pese kalvo.
8. noudata valmistajan ohjeita kemiluminesenssien havaitsemiseen.

Pohjoista Blottia

Pohjoista blottia käytetään tiettyjen RNA-sekvenssien identiteetin, koon ja runsauden määrittämiseen. Northern blot-protokollat alkavat RNA: n eristämisellä, ja erotustekniikat vaihtelevat RNA: n koon mukaan. Suuret Rnat erotetaan elektroforeesilla formaldehydiagaroosigeelillä tai glyoksaali-agaroosigeelillä, joka estää normaalin emäsparsauksen ja pitää RNA: n denaturoidussa tilassa. Pienet Rnat erotetaan denaturoimalla (urea) polyakryyliamidigeelillä. Tämän jälkeen RNA siirretään geelistä nailonkalvoon, jota inkuboidaan radioaktiivisesti tai ei-isotopisesti merkityllä RNA -, DNA-tai oligodeoksinukleotidianturilla. Hybridisoimaton luotain poistetaan pesemällä puskurilla. Radioleimatut koettimet visualisoidaan Röntgenfilmillä ja entsymaattisesti merkityt koettimet visualisoidaan kemiluminesenssilla.

Northern blot protocol

1. RNA-eristäminen
2. elektroforeesi:
   • formaldehydiagaroosigeelille: valmistetaan geeli ja asetetaan geeliastia laitteeseen. Täytä MOPS-puskurilla, lataa näytteet ja liitä mukaan molekyylipainomerkki. Suorita geeli, sitten leikata geeli ennen blotting.
   • glyoksaali-agaroosigeeli: valmistetaan geeli ja asetetaan geeliastia laitteeseen. Täytä MOPS-puskurilla, valmistele näytteet ja lataa kuoppiin RNA-tikapuiden mukana.
   • denaturoivalle polyakryyliamidigeelille: valetaan geeli ja kiinnitetään elektroforeesiyksikköön. Valmistele näytteet, lataa geeliin ja aja TBE: n juoksevalla puskurilla.
3. siirto:
   • formaldehydiagaroosigeelille tai glyoksaali-agaroosigeelille: pese geeli SSC: ssä ja kokoa siirtoyksikkö geelillä, suodatinpaperilla ja nailonkalvolla. Kun siirto on valmis, aseta kalvo UV cross-linker.
   • denaturoivalle polyakryyliamidigeelille: kokoa siirtoyksikkö sisältäen geelin, suodatinpaperin ja nailonkalvon varmistaen, että ne täyttyvät TBE: llä. Kun siirto on valmis, aseta kalvo UV-ristiinlinkeriin, jotta RNA kiinnittyy kalvoon.
4. esi-hybridisaatio (esto):
   • esi-hybridisoi kalvoa hybridisaatioliuoksessa.
5. hybridisaatio:
   • lisätään luotain hybridisaatioliuokseen ja inkuboidaan.
   • pese kalvo low-stringency pesuissa hybridisaatioliuoksen ja hybridisoimattoman koettimen poistamiseksi, ja high-stringency pesee osittain hybridisoituneiden molekyylien poistamiseksi.
   • noudata valmistajan ohjeita kemiluminesenssin havaitsemiseen.

Western Blot

Western bloteja käytetään määrittämään tiettyjen proteiinien identiteetti, koko ja runsaus näytteessä. Western blot-protokolla alkaa lysaattinäytteen valmistamisella kudoksesta tai soluviljelmästä ja erottamisella polyakryyliamidigeelillä elektroforeesin avulla. Erotetut proteiinit siirretään tämän jälkeen nitroselluloosa-tai polyvinylideenidifluoridikalvolle (PVDF). Kalvoa inkuboidaan estävällä aineella epäspesifisen sitoutumisen estämiseksi, minkä jälkeen inkuboidaan primaarisella vasta-aineella, joka sitoo kiinnostavan proteiinin. Havaintomenetelmiä on kaksi, suora ja epäsuora. Suora toteaminen (kuva 2) perustuu merkittyyn primaariseen vasta-aineeseen, kun taas epäsuora toteaminen edellyttää primaarista vasta-ainetta, joka kohdistuu kohdeproteiiniin, ja sekundaarista vasta-ainetta, joka kohdistuu primaarisen vasta-aineen lajin immunoglobiiniluokkaan tai sen alaluokkaan (kuva 3). Visualisointimenetelmiä ovat kolorimetriset määritykset, joissa syntyy värillistä saostumaa, kemiluminesenssi ja fluoresenssi.

Western blot protocol

1. valmista lysaattia soluviljelmästä tai kudoksesta.
2. näytteiden valmistus:
   • määritetään kunkin näytteen proteiinipitoisuus proteiinimäärityksellä (ts. Bradford assay).
   • lisätään jokaiseen näytteeseen yhtä suuri määrä 2x Laemmli-näytepuskuria.
   • joitakin näytteitä voidaan joutua pelkistämään tai denaturoimaan, tämä saadaan aikaan keittämällä näytteitä puskurissa.
3. elektroforeesi:
   • valmista SDS-SIVUGEELI, kuormitusnäytteet yhdessä molekyylipainomarkkerin kanssa.
   • Run the gel in running buffer.
4. siirto:
   • elektroforeesin jälkeen kootaan siirtoyksikkö mukaan lukien geeli, PVDF-tai nitroselluloosakalvo ja suodatinpaperi.
   • siirrä proteiinit kalvoon siirtopuskurilla.
5. vasta-Ainevärjäys (epäsuora toteaminen):
   • valmistetaan estopuskuri ja inkuboidaan kalvo epäspesifisen sitoutumisen vähentämiseksi.
   • inkuboidaan kalvo estopuskuriin laimennetulla primaarisella vasta-aineella.
   • pese kalvo TBST: ssä ja inkuboi konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineella, joka on laimennettu estopuskuriin.
   • pese kalvo TBST: ssä.
   • noudata valmistajan ohjeita kemiluminesenssin havaitsemiseen.