L’interférence de l’ARN par rapport au siRNA

L’ARN (ARNi) est un processus biologique dans lequel des molécules d’ARN sont utilisées pour inhiber l’expression des gènes. Typiquement, des molécules d’ARN courtes sont créées qui sont complémentaires à l’ARNm endogène et lorsqu’elles sont introduites dans les cellules, se lient à l’ARNm cible. La liaison de la molécule d’ARN court à l’ARNm cible inactive fonctionnellement l’ARNm cible et conduit parfois à sa dégradation.

Historiquement, deux types de molécules d’ARN courtes ont été utilisées dans des applications d’ARNi. Les petits ARN interférents (ARNSI) sont généralement des molécules d’ARN double brin d’une longueur de 20 à 25 nucléotides. Lorsqu’ils sont transfectés dans des cellules, les ARNsi inhibent l’ARNm cible de manière transitoire jusqu’à ce qu’ils soient également dégradés dans la cellule. Les petits ARN en épingle à cheveux (shRNA) sont des séquences d’ARN, généralement d’environ 80 paires de bases de longueur, qui comprennent une région d’hybridation interne qui crée une structure en épingle à cheveux. Les molécules de shRNA sont traitées à l’intérieur de la cellule pour former un siRNA qui à son tour détruit l’expression des gènes. L’avantage des shRNA est qu’ils peuvent être incorporés dans des vecteurs plasmidiques et intégrés dans l’ADN génomique pour une expression stable ou à plus long terme, et donc un assombrissement plus long de l’ARNm cible.

Expression efficace des shRNA à partir de Promoteurs d’ARN Polymérase III

Les petits ARN, y compris les shRNA, sont transcrits de manière endogène avec l’ARN Polymérase III (Pol III). Ceci est différent des ADNC qui sont transcrits à l’aide de l’ARN polymérase II. Par conséquent, pour garantir une expression élevée des ADNC, Cellecta utilise des promoteurs qui lient spécifiquement Pol III, les promoteurs U6 et H1. Les promoteurs U6 et H1 fonctionnent bien pour exprimer des niveaux élevés de shRNA à travers de nombreux types cellulaires, par rapport aux promoteurs Pol II tels que le CMV et l’EF1, qui n’expriment pas aussi efficacement les shRNA en raison de leur petite taille. De plus, les promoteurs Pol II utilisés pour exprimer les SHMIR peuvent ne pas fonctionner dans la plupart des types cellulaires, où U6 et H1 fonctionnent bien.

Les vecteurs lentiviraux Permettent le Renversement permanent des cibles

Le shRNA s’intègre de manière stable dans le génome de la cellule hôte. Lorsque les cellules se divisent, le shRNA est transmis aux cellules filles. L’utilisation de vecteurs lentiviraux pour l’expression des shRNA permet un knockdown permanent sans avoir besoin de transfecter les cellules plusieurs fois. Pour en savoir plus sur le fonctionnement des vecteurs lentiviraux, reportez-vous à notre page Système de vecteurs lentiviraux.

Optimisation de la conception des ARNR

La conception d’ARNR efficaces est essentielle pour un criblage efficace de l’ARNr. En plus de choisir la séquence optimale, un certain nombre de facteurs structurels affectent l’efficacité du shRNA. De plus, la structure en épingle à cheveux tige-boucle du shRNA pose des problèmes pour la construction et l’amplification de la bibliothèque. Pour créer des bibliothèques shRNA de qualité représentative, nous avons concentré des efforts importants pour optimiser l’efficacité des encarts shRNA dans nos bibliothèques. Nous avons développé un algorithme interne pour prédire les séquences de shRNA les plus efficaces et les combiner avec des données publiées de séquences validées lors de la construction de nos bibliothèques. Nous avons également optimisé la structure de shRNA pour la construction de bibliothèques.

Pour tester efficacement les variations de structure du shRNA à grande échelle, nous avons développé une technologie de test d’efficacité du shRNA à haut débit basée sur un test reporter. Il a été démontré précédemment qu’un gène rapporteur (tel que GFP) avec une fusion 3′ en un fragment d’ADNc ou un oligonucléotide court d’un gène cible pouvait être utilisé efficacement pour surveiller l’efficacité des constructions siRNA et shRNA contre ce gène cible. Sur la base de ces résultats, nous avons développé un vecteur rapporteur lentiviral pour l’identification des constructions fonctionnelles de shRNA (Figure 1). Notre vecteur rapporteur de test shRNA exclusif permet le clonage du modèle shRNA en aval du promoteur H1 et des séquences cibles à l’extrémité 3 ‘ du rapporteur GFP. Lorsque cette construction est transduite dans des cellules, la transcription à partir du promoteur H1 produit un ARNt, tandis que la transcription à partir du promoteur CMV génère un transcription de fusion d’ARNm cible à détection GFP qui peut être utilisé comme rapporteur pour le criblage des ARNT fonctionnels.

Carte de la construction rapporteuse lentivirale cible de l’ARNt intégrée dans l’ADN génomique et mécanisme de renversement du rapporteur cible du GFP. Les cellules transduites avec des constructions de shRNA fonctionnelles auront de faibles niveaux d’ARNm GFP, tandis que les shRNA non fonctionnels permettront un niveau élevé d’expression de l’ARNm GFP.

Pour optimiser la structure du shRNA, nous avons construit une bibliothèque cible shRNA dans le vecteur de validation shRNA pour 150 shRNA, chaque shRNA étant construit selon 40 conceptions différentes décrites dans la littérature.

Nous avons réalisé des écrans ARNi dans des cellules CHO-TRex transduites avec cette bibliothèque cible shRNA codée 150×40 à barres et une représentation mesurée (dans la bibliothèque et les cellules transduites) et l’efficacité de knockdown de chaque construction shRNA. Certaines données représentatives de ce dépistage sont présentées ci-dessous.

Les dix meilleures conceptions ont été sélectionnées en fonction de celles ayant l’activité de knockdown cible la plus élevée, une efficacité d’amplification égale de même conception mise en commun oligonucléotides, et représentation égale des shRNA de même conception dans les bibliothèques d’ARNi regroupées. L’efficacité de knockdown de trois shRNA p53 construits avec ces 10 meilleures conceptions dans un vecteur lentiviral a été analysée par RT-PCR après transduction dans des cellules de fibroblastes de souris.