Quelle est la différence entre un transfert Southern, Northern et Western?

Différentes techniques de buvardage sont utilisées pour identifier des protéines et des séquences d’acides nucléiques uniques. Les protocoles Southern, northern et western blot sont similaires et commencent par la séparation électrophorétique de fragments de protéines et d’acides nucléiques sur un gel, qui sont ensuite transférés sur une membrane (membrane de nitrocellulose, membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF), etc.) où ils sont immobilisés. Cela permet à des anticorps ou à des sondes d’ADN radiomarqués ou marqués par voie enzymatique de lier la cible immobilisée, et les molécules d’intérêt peuvent ensuite être visualisées avec diverses méthodes. Les techniques de buvardage sont sélectionnées en fonction de la molécule cible : ADN, ARN ou protéine. (Figure 1, tableau 1).

Southern Blot

Les Southern blots sont utilisés pour déterminer l’identité, la taille et l’abondance de séquences d’ADN spécifiques. Le protocole southern blot commence par l’extraction de l’ADN des cellules ou des tissus, qui est ensuite digéré par voie enzymatique pour produire des fragments d’ADN. Les fragments sont séparés par taille sur un gel d’agarose ou de polyacrylamide par électrophorèse. Les fragments plus petits migreront plus loin sur le gel que les plus gros. Après électrophorèse, l’ADN sur le gel est transféré sur une membrane en nylon. La membrane est incubée avec une sonde d’acide nucléique ayant une séquence homologue à la séquence cible et marquée avec de la radioactivité, un colorant fluorescent ou une enzyme capable de générer un signal chimioluminescent. L’hybridation de séquences complémentaires se produit pendant l’incubation, et la sonde non hybridée est retirée par lavage au tampon. Les molécules sondes marquées entièrement hybridées resteront liées au blot. Les méthodes de détection diffèrent en fonction de l’étiquette de la sonde; les sondes radiomarquées sont visualisées avec un film radiographique ou une phosphorimagerie, et les sondes marquées enzymatiquement sont visualisées avec un substrat chimiluminescent.

Protocole Southern blot

1. Isolement de l’ADN
2. Digestion par restriction: digérer l’ADN avec une enzyme de restriction et, si nécessaire, concentrer l’ADN digéré.
3. Électrophorèse sur gel : préparer un gel d’agarose et un tampon TAE ou TBE (le choix du tampon dépendra de la durée de l’essai et de la taille des fragments d’ADN). Chargez les échantillons dans des puits et incluez un marqueur de poids moléculaire de l’ADN. Lance le gel.
4. Transfert:
   • Placer le gel dans un récipient contenant une solution dénaturante et laver deux fois pendant 15 minutes sur un shaker.
   • Rincer à l’eau, puis laver avec une solution de neutralisation.
   • Au cours de l’étape précédente, commencez à préparer le papier Whatman et la membrane en nylon pour le transfert.
   • Assemblez l’appareil de transfert avec la membrane, le papier Whatman et le gel et transférez-le dans un tampon SSC ou SSPE.
   • Lorsque le transfert est terminé, réticulez l’ADN dans un agent de réticulation, puis rincez la membrane.
5. Pré-hybridation (blocage):Le blocage
   • réduit la liaison non spécifique à la membrane. Préparer la solution de pré-hybridation et ajouter un échantillon d’ADN. Retirer la tache du réticuleur, ajouter la solution de pré-hybridation et incuber.
6. Hybridation :
   • Préparer le mélange sonde (un brin d’ADN complémentaire) et le tampon.
   • Retirer la solution de pré-hybridation et incuber la tache avec la sonde (les temps d’incubation varient en fonction de l’application).
   • Après l’incubation, effectuer un lavage à faible stringence suivi d’un lavage à haute stringence pour affiner l’ADN.
7. Détection de la sonde:
   • Rincer la membrane, transférer dans un récipient contenant une solution de blocage et incuber.
   • Jeter la solution de blocage, la remplacer par une solution d’anticorps et l’incuber.
   • Jeter la solution d’anticorps, laver la membrane.
8. Suivez les instructions du fabricant pour la détection chimiluminescente.

Northern Blot

Les Northern blots sont utilisés pour déterminer l’identité, la taille et l’abondance de séquences d’ARN spécifiques. Les protocoles Northern blot commencent par l’isolement de l’ARN et les techniques de séparation varient en fonction de la taille de l’ARN. Les grands ARN sont séparés par électrophorèse sur un gel d’agarose de formaldéhyde ou un gel d’agarose de glyoxal, ce qui empêche la séparation normale des bases et maintient l’ARN dans un état dénaturé. Les petits ARN sont séparés sur un gel de polyacrylamide dénaturant (urée). L’ARN est ensuite transféré du gel vers une membrane en nylon qui est ensuite incubée avec une sonde d’ARN, d’ADN ou d’oligodésoxynucléotide marquée de manière radioactive ou non isotopique. La sonde non hybridée est retirée par lavage au tampon. Les sondes radiomarquées sont visualisées avec un film radiographique, et les sondes marquées enzymatiquement sont visualisées avec une chimiluminescence.

Protocole Northern blot

1. Isolement de l’ARN
2. Électrophorèse :
   • Pour un gel d’agarose de formaldéhyde : préparer le gel et insérer le plateau de gel dans l’appareil. Remplir avec un tampon de VADROUILLE, charger les échantillons et inclure un marqueur de poids moléculaire. Exécutez le gel, puis coupez le gel avant de le buvarder.
   • Pour un gel d’agarose glyoxal : préparer le gel et insérer le plateau de gel dans l’appareil. Remplir avec un tampon de VADROUILLE, préparer des échantillons et charger dans des puits avec une échelle d’ARN.
   • Pour un gel de polyacrylamide dénaturant : couler le gel et le monter dans l’unité d’électrophorèse. Préparez les échantillons, chargez-les dans le gel et exécutez-les avec le tampon de fonctionnement TBE.
3. Transfert:
   • Pour un gel d’agarose au formaldéhyde ou un gel d’agarose au glyoxal: laver le gel en SSC, puis assembler l’unité de transfert avec le gel, le papier filtre et la membrane en nylon. Lorsque le transfert est terminé, placez la membrane dans un réticuleur UV.
   • Pour un gel de polyacrylamide dénaturant : assemblez l’unité de transfert comprenant le gel, le papier filtre et la membrane en nylon en vous assurant qu’ils sont inondés de TBE. Lorsque le transfert est terminé, placez la membrane dans un réticuleur UV pour fixer l’ARN à la membrane.
4. Pré-hybridation (blocage):
   • Pré-hybridation de la membrane en solution d’hybridation.
5. Hybridation:
   • Ajouter une sonde à la solution d’hybridation et incuber.
   • Laver la membrane dans des lavages à faible stringence pour éliminer la solution d’hybridation et la sonde non hybridée, et des lavages à haute stringence pour éliminer les molécules partiellement hybridées.
   • Suivez les instructions du fabricant pour la détection chimiluminescente.

Western Blot

Les Western blots sont utilisés pour déterminer l’identité, la taille et l’abondance de protéines spécifiques dans un échantillon. Le protocole western blot commence par la préparation d’échantillons de lysat à partir d’une culture tissulaire ou cellulaire et la séparation sur un gel de polyacrylamide par électrophorèse. Les protéines séparées sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose ou de difluorure de polyvinylidène (PVDF). La membrane est incubée avec un agent bloquant pour empêcher la liaison non spécifique, suivie d’une incubation avec un anticorps primaire pour lier la protéine d’intérêt. Il existe deux méthodes de détection, directe et indirecte. La détection directe (figure 2) repose sur un anticorps primaire marqué, tandis que la détection indirecte nécessite un anticorps primaire dirigé contre la protéine cible et un anticorps secondaire dirigé contre la classe ou la sous-classe d’immunoglobine de l’espèce de l’anticorps primaire (Figure 3). Les méthodes de visualisation comprennent des essais colorimétriques dans lesquels un précipité coloré est produit, une chimiluminescence et une fluorescence.

Protocole Western blot

1. Préparer du lysat à partir de cultures cellulaires ou de tissus.
2. Préparation de l’échantillon:
   • Déterminer la concentration en protéines de chaque échantillon à l’aide d’un test de quantification des protéines (c.-à-d. Test de Bradford).
   • Ajoutez un volume égal de 2X Tampon d’échantillon Laemmli à chaque échantillon.
   • Certains échantillons peuvent avoir besoin d’être réduits ou dénaturés, ceci est réalisé en faisant bouillir des échantillons dans du tampon.
3. Électrophorèse:
   • Préparez un gel de PAGE SDS, chargez les échantillons avec un marqueur de poids moléculaire.
   • Exécutez le gel dans le tampon en cours d’exécution.
4. Transfert:
   • Après électrophorèse, assembler l’unité de transfert comprenant le gel, la membrane de PVDF ou de nitrocellulose et le papier filtre.
   • Transférez les protéines sur la membrane avec un tampon de transfert.
5. Coloration des anticorps (détection indirecte):
   • Préparer un tampon bloquant et incuber la membrane pour réduire la liaison non spécifique.
   • Incuber la membrane avec l’anticorps primaire dilué dans un tampon bloquant.
   • Laver la membrane en TBST et incuber avec un anticorps secondaire conjugué dilué dans un tampon bloquant.
   • Laver la membrane en TBST.
   • Suivez les instructions du fabricant pour la détection chimiluminescente.