mi a különbség a déli, északi és Western Blot között?

különböző blotolási technikákat alkalmaznak az egyedi fehérjék és nukleinsavszekvenciák azonosítására. A déli, az északi és a western blot protokollok hasonlóak, és a fehérje és a nukleinsav fragmensek elektroforetikus elválasztásával kezdődnek egy gélen, amelyet ezután egy membránra (nitrocellulóz membrán, polivinilidén-difluorid (PVDF) membrán stb.) ahol immobilizálódnak. Ez lehetővé teszi radioaktívan jelölt vagy enzimatikusan jelölt antitest vagy DNS-szondák megkötését az immobilizált célponthoz, majd a kérdéses molekulákat különféle módszerekkel vizualizálhatjuk. A blotolási technikákat a célmolekula alapján választják ki: DNS, RNS vagy fehérje. (1. Ábra, 1. Táblázat).

Southern Blot

a déli blotokat használják a specifikus DNS-szekvenciák azonosságának, méretének és bőségének meghatározására. A southern blot protokoll a sejtekből vagy szövetekből származó DNS-extrakcióval kezdődik, amelyet enzimatikusan emésztünk DNS-fragmensek előállítására. A fragmenseket méret szerint elválasztjuk egy agaróz vagy poliakrilamid gélen elektroforézis útján. A kisebb töredékek távolabb vándorolnak a gélen, mint a nagyobbak. Elektroforézist követően a gélen lévő DNS átkerül egy nejlon membránra. A membránt egy nukleinsav-szondával inkubáljuk, amelynek szekvenciája homológ a célszekvenciával, radioaktivitással, fluoreszcens festékkel vagy egy kemilumineszcens jel előállítására képes enzimmel van jelölve. A komplementer szekvenciák hibridizációja az inkubáció során történik, a nem hibridizált szondát pufferrel történő mosással távolítják el. A teljesen hibridizált jelölt szondamolekulák továbbra is kötődnek a folthoz. Az észlelési módszerek a szonda címkéjén alapulnak; a radioaktívan jelölt szondákat Röntgenfilmmel vagy foszforképezéssel, az enzimatikusan jelölt szondákat pedig kemilumineszcens szubsztráttal vizualizálják.

Southern blot protokoll

1. DNS izolálás
2. restrikciós emésztés: a DNS-t restrikciós enzimmel emésztjük, és szükség esetén koncentráljuk az emésztett DNS-t.
3. gélelektroforézis: készítsen elő egy agaróz gélt és Tae vagy TBE puffert (a puffer kiválasztása a futás időtartamától és a DNS-fragmensek méretétől függ). Töltsön be mintákat kutakba, és tartalmazzon egy DNS molekulatömeg-jelölőt. Futtassa a gélt.
4. transzfer:
   • helyezze a gélt denaturáló oldattal ellátott edénybe, majd kétszer 15 percig mossa le rázógépen.
   • öblítse le vízzel, majd mossa le semlegesítő oldattal.
   • az előző lépés során kezdje el előkészíteni a Whatman papírt és a nejlon membránt az átvitelhez.
   • szerelje össze az átviteli készüléket a membránnal, a Whatman papírral és a géllel, és helyezze át SSC vagy SSPE pufferben.
   • amikor az átvitel befejeződött, keresztkapcsolja a DNS-t egy keresztkapcsolóban, majd öblítse le a membránt.
5. Pre-hibridizáció (blokkolás):
   • A blokkolás csökkenti a membránhoz való nem specifikus kötődést. Készítse elő a pre-hibridizációs oldatot, és adjon hozzá DNS-mintát. Távolítsa el a foltot a keresztkötőből, adja hozzá a pre-hibridizációs oldatot és inkubálja.
6. hibridizáció:
   • készítse elő a szondakeveréket (egy komplementer DNS-szálat) és a puffert.
   • távolítsa el a pre-hibridizációs oldatot, és inkubálja a foltot a szondával (az inkubációs idő az alkalmazástól függően változik).
   • az inkubálást követően végezzen egy alacsony húrú mosást, majd egy magas húrú mosást a DNS finomításához.
7. szonda észlelése:
   • öblítse le a membránt, helyezze át egy blokkoló oldattal ellátott tartályba, majd inkubálja.
   • dobja ki a blokkoló oldatot, cserélje ki antitestoldattal és inkubálja.
   • dobja ki az antitest oldatot, mossa le a membránt.
8. kövesse a gyártó utasításait a kemilumineszcens detektáláshoz.

Northern Blot

az Északi blotok a specifikus RNS-szekvenciák azonosságának, méretének és bőségének meghatározására szolgálnak. A Northern blot protokollok az RNS izolálásával kezdődnek, és az elválasztási technikák az RNS méretétől függően változnak. A nagy RNS-eket formaldehid-agaróz gélen vagy glioxál-agaróz gélen végzett elektroforézissel választják el egymástól, amely megakadályozza a normál bázismegdarabolást és denaturált állapotban tartja az RNS-t. A kis RNS-eket denaturáló (karbamid) poliakrilamid gélen választják el. Az RNS-t ezután a gélből egy nejlonmembránba viszik át, amelyet radioaktívan vagy nem izotopikusan jelölt RNS-sel, DNS-sel vagy oligodeoxinukleotid-szondával inkubálunk. A nem hibridizált szondát pufferrel történő mosással távolítják el. A radioizotóppal jelölt szondákat Röntgenfilmmel, az enzimatikusan jelölt próbákat pedig kemilumineszcenciával vizualizálják.

Northern blot protokoll

1. RNS izolálás
2. elektroforézis:
   • formaldehid agaróz gél esetén: készítse elő a gélt, és helyezze be a géltálcát a készülékbe. Töltse fel a MOPS puffert, töltse be a mintákat és tartalmazzon egy molekulatömeg-jelölőt. Futtassa a gélt, majd blotolás előtt vágja le a gélt.
   • glioxál-agaróz gél esetében: készítse elő a gélt, és helyezze be a géltálcát a készülékbe. Töltse fel a MOPS puffert, készítsen mintákat és töltsön be kutakba az RNS létrával együtt.
   • denaturáló poliakrilamid gél esetén: öntse le a gélt, és szerelje fel az elektroforézis egységbe. Készítse elő a mintákat, töltse be a gélbe, majd futtassa a TBE futó pufferrel.
3. transzfer:
   • formaldehid agaróz gél vagy glyoxal agaróz gél esetén: mossa le a gélt SSC-ben, majd szerelje össze az átviteli egységet a géllel, a szűrőpapírral és a nejlon membránnal. Amikor az átvitel befejeződött, helyezze a membránt egy UV keresztkötőbe.
   • denaturáló poliakrilamid gél esetén: szerelje össze az átviteli egységet, beleértve a gélt, a szűrőpapírt és a nejlon membránt, biztosítva, hogy TBE-vel elárasztják őket. Amikor az átvitel befejeződött, helyezze a membránt egy UV keresztkapcsolóba, hogy rögzítse az RNS-t a membránhoz.
4. Pre-hibridizáció (blokkolás):
   • Pre-hibridizálja a membránt hibridizációs oldatban.
5. hibridizáció:
   • adjunk hozzá szondát a hibridizációs oldathoz és inkubáljuk.
   • mossa le a membránt alacsony húrú mosásokban a hibridizációs oldat és a nem hibridizált szonda eltávolítása érdekében, a nagy húrú mosásokat pedig a részben hibridizált molekulák eltávolítására.
   • kövesse a gyártó utasításait a kemilumineszcens detektáláshoz.

Western Blot

A Western blotokat használják a mintában lévő specifikus fehérjék azonosságának, méretének és bőségének meghatározására. A western blot protokoll a minta lizátum előkészítésével kezdődik szövetből vagy sejttenyészetből, majd elektroforézissel poliakrilamid gélen történő elválasztással. Az elválasztott fehérjéket ezután nitrocellulóz vagy polivinilidén-difluorid (PVDF) membránba helyezzük. A membránt blokkoló szerrel inkubáljuk a nem specifikus kötődés megakadályozása érdekében, majd egy primer antitesttel inkubáljuk az érdekes fehérje megkötésére. Két detektálási módszer létezik, közvetlen és közvetett. A közvetlen kimutatás (2.ábra) egy jelölt elsődleges antitestre támaszkodik, míg a közvetett kimutatáshoz a célfehérje ellen irányított elsődleges antitestre, valamint az elsődleges antitest fajainak immunoglobin osztályára vagy alosztályára irányuló másodlagos antitestre van szükség (3. ábra). A vizualizációs módszerek közé tartoznak a kolorimetriás vizsgálatok, amelyekben színes csapadék keletkezik, kemilumineszcencia, fluoreszcencia.

Western blot protokoll

1. készítsünk lizátumot sejttenyészetből vagy szövetből.
2. minta előkészítése:
   • határozza meg az egyes minták fehérjekoncentrációját egy fehérje kvantifikációs vizsgálattal (azaz. Bradford-vizsgálat).
   • adjon hozzá egyenlő térfogatú 2x Laemmli mintapuffert minden mintához.
   • egyes mintákat csökkenteni vagy denaturálni kell, ezt a minták pufferben történő forralásával érik el.
3. elektroforézis:
   • készítsen elő egy SDS-oldal gélt, töltsön be mintákat a molekulatömeg-jelölővel együtt.
   • futtassa a gélt futó pufferben.
4. transzfer:
   • elektroforézist követően szerelje össze az átviteli egységet, beleértve a gélt, PVDF vagy nitrocellulóz membránt és a szűrőpapírt.
   • vigye át a fehérjéket a membránra transzfer pufferrel.
5. Antitestfestés (közvetett kimutatás):
   • készítse elő a blokkoló puffert és inkubálja a membránt a nem specifikus kötődés csökkentése érdekében.
   • inkubáljuk a membránt blokkoló pufferben hígított primer antitesttel.
   • mossuk ki a membránt TBST-ben, és inkubáljuk a blokkoló pufferben hígított konjugált másodlagos antitesttel.
   • mossa le a membránt TBST-ben.
   • kövesse a gyártó utasításait a kemilumineszcens detektáláshoz.