Due degli strumenti genetici più interessanti e versatili progettati negli ultimi 30 anni sono le tecnologie Cre-lox e FLP-FRT. Entrambi permettono che la posizione e la sincronizzazione di espressione genica siano strettamente regolate. Questo articolo descrive brevemente come funzionano i due sistemi e possono essere utilizzati nei modelli di mouse.
Il sistema Cre-lox
La tecnologia Cre-lox è stata introdotta nel 1980 (Sauer e Henderson 1988; Sternberg e Hamilton 1981) e brevettata da DuPont Pharmaceuticals. È stato applicato con successo in lieviti, piante, colture cellulari di mammiferi e topi (Araki et al. 1987). Si basa sulla capacità del gene della ricombinasi (Cre) della ricombinazione di ciclizzazione del batteriofago P1 (cre) di effettuare la ricombinazione tra coppie di siti loxP. Tale ricombinazione in un topo” Cre-lox ” (vedi sotto) può attivare o inattivare un gene di interesse.
Per utilizzare la tecnologia Cre-lox, un investigatore deve produrre un mouse Cre-lox, in genere allevando un mouse Cre in un mouse loxP. Un topo Cre contiene un transgene ricombinasi Cre sotto la direzione di un promotore tessuto-specifico; un topo loxP contiene due siti loxP che fiancheggiano un segmento genomico di interesse, il locus “floxed”. Tipicamente, i topi Cre e LOXP sono prodotti utilizzando la tecnologia transgenica (Nagy 2000). A seconda dei promotori e di altri controlli normativi utilizzati per costruirli, i topi Cre possono essere progettati per esprimere la ricombinasi Cre solo in determinate condizioni, tra cui quanto segue: in alcuni tessuti, quando la dieta di un topo è integrata con sostanze come doxiciclina, tetraciclina, RU486 e tamoxifene (Brocard et al. 1998; Kellendonk et al. 1999; Utomo et al. 1999) e durante alcune fasi di sviluppo.
A seconda della posizione e dell’orientamento dei siti loxP in un mouse Cre-lox, la ricombinasi Cre può avviare eliminazioni, inversioni e traslocazioni del locus floxed (Nagy 2000) (Fig. 1).
Fig. 1.
Le reazioni Cre-lox sono influenzate dall’orientamento e dalla posizione dei siti loxP. I siti LOXP accoppiati (triangoli) hanno direzionalità e possono essere collocati in una disposizione cis (stesso filamento di DNA) o trans (diversi filamenti di DNA). (A) Se i siti loxP fiancheggiano un segmento di DNA (rettangolo) in una disposizione cis e sono orientati nella stessa direzione, Cre ricombinasi media escissione o circolarizzazione del segmento. (B) Se i siti loxP fiancheggiano il segmento di DNA in una disposizione cis e sono orientati in direzioni opposte, Cre ricombinasi media l’inversione del segmento. (C) Se i siti loxP si trovano su diversi filamenti di DNA e sono orientati nella stessa direzione, la ricombinasi Cre media una traslocazione del segmento.
Di solito, i ceppi Cre e loxP vengono sviluppati indipendentemente e quindi incrociati. Molti ceppi Cre diversi, ciascuno contenente un transgene Cre sotto la direzione di un diverso promotore specifico del tessuto, possono essere incrociati con un singolo ceppo loxP. A seconda di quali ceppi sono accoppiati, è possibile costruire una varietà di sistemi modello Cre-mediati, tra cui transgenici, knockout, ipomorfi, ipomorfi riparabili, aberranti cromosomici e mutanti indotti dalla dieta. In effetti, mescolando e abbinando ceppi Cre e loxP, un investigatore può studiare gli effetti di un gene in modi specifici per lo stadio di sviluppo e specifici per il tessuto che prima erano impossibili.
Il sistema FLP-FRT
Il sistema FLP-FRT è simile al sistema Cre-lox e sta diventando più frequentemente utilizzato nella ricerca basata sul mouse. Si tratta di utilizzare flippase (FLP) ricombinasi, derivato dal lievito Saccharomyces cerevisiae (Sadowski 1995). FLP riconosce una coppia di sequenze FLP recombinase target (FRT) che fiancheggiano una regione genomica di interesse.
Araki K, Imaizumi T, Okuyama K, Oike Y, Yamamura K. 1997. Efficienza della ricombinazione mediante espressione transitoria Cre nelle cellule staminali embrionali: confronto tra vari promotori. J Biochem (Tokyo) 122: 977-82.
Brocard J, Feil R, Chambon P, Metzger D. 1998 Una Cre chimerica ricombinasi inducibile da ligandi sintetici, ma non naturali del recettore glucocorticoide. Acidi nucleici Res 26:4086-90.
NOTE JAX. 1999. NIH, Jackson Laboratory e DuPont Pharmaceuticals firmano accordi di utilizzo della tecnologia Cre-lox. JAX NOTE 476: 4.
Kellendonk C, Tronche F, Reichardt HM, Schutz G. 1999. Mutagenesi del recettore glucocorticoide nei topi. J Steroide Biochem Mol Biol 69: 253-9.
Nagy A. 2000. Cre ricombinasi: il reagente universale per la sartoria del genoma. Genesi 26:99-109.
Sadowski P. 1995. La ricombinasi Flp del plasmide 2-µm di Saccharomyces cerevisiae. Acido nucleico Prog Res Mol Biol 51:53-91.
Sauer B, Henderson N. 1988. Ricombinazione del DNA sito-specifico nelle cellule di mammifero mediante la ricombinasi Cre del batteriofago P1. Proc Natl Acad Sci U S A 85: 5166-70.
Sternberg N, Hamilton D. 1981. Batteriofago P1 ricombinazione site-specific. I. Ricombinazione tra siti loxP. J Mol Biol 150: 467-86.
Utomo AR, Nikitin AY, Lee WH. 1999. Controllo temporale, spaziale e specifico del tipo cellulare della ricombinazione del DNA Cre-mediata in topi transgenici. Nat Biotechnol 17:1091-6.