shRNA versus siRNA

L’interferenza dell’RNA (RNAi) è un processo biologico in cui le molecole di RNA vengono utilizzate per inibire l’espressione genica. Tipicamente, vengono create molecole di RNA brevi che sono complementari all’mRNA endogeno e quando vengono introdotte nelle cellule, si legano all’mRNA target. Il legame della molecola di RNA corta con l’mRNA target inattiva funzionalmente l’mRNA target e talvolta porta alla degradazione dell’mRNA target.

Storicamente, due tipi di molecole di RNA brevi sono stati utilizzati nelle applicazioni RNAi. I piccoli RNA interferenti (siRNA) sono tipicamente molecole di RNA a doppio filamento, 20-25 nucleotidi di lunghezza. Quando transfected nelle cellule, siRNA inibire l’mRNA bersaglio transitoriamente fino a quando non sono anche degradati all’interno della cellula. Piccoli RNA tornante (shRNA) sono sequenze di RNA, tipicamente circa 80 coppie di basi di lunghezza, che includono una regione di ibridazione interna che crea una struttura tornante. Le molecole di shRNA sono elaborate all’interno della cellula per formare il siRNA che a sua volta abbatte l’espressione genica. Il vantaggio di shRNA è che possono essere incorporati in vettori plasmidici e integrati nel DNA genomico per un’espressione a lungo termine o stabile, e quindi un abbattimento più lungo dell’mRNA target.

Espressione efficace degli SHRNA dai promotori della RNA polimerasi III

Piccoli RNA inclusi gli SHRNA sono trascritti endogenicamente con RNA Polimerasi III (Pol III). Questo è diverso dai CDNA che vengono trascritti utilizzando RNA polimerasi II. Pertanto, per garantire un’elevata espressione di SHRNA, Cellecta utilizza promotori che legano specificamente Pol III, i promotori U6 e H1. Entrambi i promotori U6 e H1 funzionano bene per esprimere alti livelli di SHRNA in molti tipi di cellule, rispetto ai promotori Pol II come CMV ed EF1, che non esprimono SHRNA in modo efficace a causa delle loro piccole dimensioni. Inoltre, i promotori Pol II utilizzati per esprimere SHMIR potrebbero non funzionare nella maggior parte dei tipi di cellule, dove U6 e H1 funzionano bene.

I vettori lentivirali consentono l’abbattimento permanente di bersagli

Lo shRNA si integra stabilmente nel genoma della cellula ospite. Quando le cellule si dividono, lo shRNA viene trasmesso alle cellule figlie. L’utilizzo di vettori lentivirali per l’espressione di SHRNA fornisce un knockdown permanente senza la necessità di trasfettare le cellule più volte. Per saperne di più su come funzionano i vettori lentivirali, consulta la nostra pagina del sistema vettoriale lentivirale.

Ottimizzazione del design shRNA

La progettazione di SHRNA efficaci è essenziale per un efficace screening RNAi knockdown. Oltre a scegliere la sequenza ottimale, ci sono una serie di fattori strutturali che influenzano l’efficacia di shRNA. Inoltre, la struttura a tornante stem-loop di shRNA pone problemi per la costruzione e l’amplificazione della biblioteca. Per creare librerie shRNA di qualità rappresentativa, abbiamo concentrato uno sforzo significativo per ottimizzare l’efficacia degli inserti shRNA nelle nostre librerie. Abbiamo sviluppato un algoritmo interno per prevedere le sequenze shRNA più efficaci e combinarle con i dati pubblicati delle sequenze convalidate durante la costruzione delle nostre librerie. Abbiamo anche ottimizzato la struttura di shRNA per la costruzione della biblioteca.

Per testare in modo efficiente le variazioni della struttura shRNA su larga scala, abbiamo sviluppato una tecnologia di test di efficacia shRNA ad alta produttività basata su un test reporter. In precedenza è stato dimostrato che un gene reporter (come GFP) con una fusione 3′ a un frammento di cDNA o un oligonucleotide corto da un gene bersaglio potrebbe essere efficacemente utilizzato per monitorare l’efficacia dei costrutti siRNA e shRNA contro questo gene bersaglio. Sulla base di questi risultati, abbiamo sviluppato un vettore reporter lentivirale per l’identificazione di costrutti shRNA funzionali (Figura 1). Il nostro vettore proprietario shRNA testing reporter consente la clonazione di entrambi i modelli shRNA a valle del promotore H1 e delle sequenze target all’estremità 3 ‘ del reporter GFP. Quando questo costrutto viene trasdotto in cellule, la trascrizione dal promotore H1 produce shRNA, mentre la trascrizione dal promotore CMV genera una trascrizione di fusione mRNA target GFP-sense che può essere utilizzata come reporter per lo screening degli SHRNA funzionali.

Mappa di shRNA-target lentiviral reporter construct integrato nel DNA genomico e meccanismo di knockdown di GFP-target reporter. Le cellule trasdotte con costrutti shRNA funzionali avranno bassi livelli di mRNA GFP, mentre gli SHRNA non funzionali consentono un alto livello di espressione di mRNA GFP.

Per ottimizzare la struttura dello shRNA, abbiamo costruito una libreria shRNA-target nel vettore di convalida shRNA per 150 SHRNA, con ogni shRNA costruito in 40 diversi disegni descritti in letteratura.

Abbiamo eseguito schermi RNAi in celle CHO-TRex trasdotte con questa libreria shRNA-Target con codice a barre 150×40 e misurato la rappresentazione (nella libreria e nelle celle trasdotte) e l’efficienza di knockdown di ogni costrutto shRNA. Di seguito sono riportati alcuni dati rappresentativi di questo screening.

I dieci migliori progetti sono stati selezionati sulla base di quelli che hanno il più alto obiettivo atterramento di attività, pari efficienza di amplificazione dello stesso design di un pool di oligonucleotidi, e la pari rappresentanza di design shRNAs nel pool di librerie di RNAi. L’efficienza di abbattimento di tre SHRNA p53 costruiti con questi 10 migliori disegni in un vettore lentivirale è stata ulteriormente analizzata da RT-PCR dopo la trasduzione in cellule di fibroblasti di topo.