Qual è la differenza tra un Southern, Northern e Western Blot?

Diverse tecniche di blotting sono utilizzate per identificare proteine uniche e sequenze di acidi nucleici. I protocolli Southern, northern e western blot sono simili e iniziano con la separazione elettroforetica di frammenti di proteine e acidi nucleici su un gel, che vengono poi trasferiti su una membrana (membrana di nitrocellulosa, membrana di difluoruro di polivinilidene (PVDF), ecc.) dove sono immobilizzati. Ciò permette alle sonde radiomarcate o enzimaticamente etichettate dell’anticorpo o del DNA di legare l’obiettivo immobilizzato e le molecole di interesse possono poi essere visualizzate con i vari metodi. Le tecniche di blotting sono selezionate in base alla molecola bersaglio: DNA, RNA o proteina. (Figura 1, Tabella 1).

Southern Blot

Le Southern blot vengono utilizzate per determinare l’identità, la dimensione e l’abbondanza di specifiche sequenze di DNA. Il protocollo southern blot inizia con l’estrazione del DNA dalle cellule o dai tessuti, che viene quindi digerito enzimaticamente per produrre frammenti di DNA. I frammenti sono separati per dimensione su un gel di agarosio o poliacrilammide tramite elettroforesi. Frammenti più piccoli migreranno più lontano sul gel rispetto a quelli più grandi. Dopo l’elettroforesi, il DNA sul gel viene trasferito su una membrana di nylon. La membrana viene incubata con una sonda di acido nucleico che ha una sequenza omologa alla sequenza bersaglio ed è etichettata con radioattività, colorante fluorescente o un enzima in grado di generare un segnale chemiluminescente. L’ibridazione delle sequenze complementari avviene durante l’incubazione e la sonda non ibridata viene rimossa lavando con tampone. Le molecole della sonda etichettate completamente ibridate rimarranno legate alla macchia. I metodi di rilevamento differiscono in base all’etichetta della sonda; le sonde radiomarcate vengono visualizzate con pellicola a raggi X o fosforimaging e le sonde etichettate enzimaticamente vengono visualizzate con substrato chemiluminescente.

Southern blot protocol

1. Isolamento del DNA
2. Digestione di restrizione: digerire il DNA con un enzima di restrizione e, se necessario, concentrare il DNA digerito.
3. Elettroforesi su gel: preparare un gel di agarosio e un tampone TAE o TBE (la selezione del tampone dipenderà dalla durata della corsa e dalla dimensione dei frammenti di DNA). Caricare i campioni nei pozzetti e includere un marcatore del peso molecolare del DNA. Esegui il gel.
4. Transfer:
   • Posizionare il gel in un contenitore con soluzione denaturante e lavare due volte per 15 minuti su uno shaker.
   • Risciacquare con acqua, quindi lavare con soluzione di neutralizzazione.
   • Durante il passaggio precedente, iniziare a preparare la carta Whatman e la membrana di nylon per il trasferimento.
   • Montare l’apparecchio di trasferimento con la membrana, la carta Whatman e il gel e trasferire in buffer SSC o SSPE.
   • Quando il trasferimento è completo, cross-link DNA in un cross-linker, quindi risciacquare la membrana.
5. Preibridizzazione (blocco):
   • Il blocco riduce il legame non specifico alla membrana. Preparare la soluzione di pre-ibridazione e aggiungere il DNA del campione. Rimuovere la macchia dal cross-linker, aggiungere la soluzione di pre-ibridazione e incubare.
6. Ibridazione:
   • Preparare la miscela della sonda (un filamento di DNA complementare) e il tampone.
   • Rimuovere la soluzione di pre-ibridazione e incubare la macchia con la sonda (i tempi di incubazione variano a seconda dell’applicazione).
   • Dopo l’incubazione, eseguire un lavaggio a bassa rigidità seguito da un lavaggio ad alta rigidità per affinare il DNA.
7. Rilevamento della sonda:
   • Sciacquare la membrana, trasferire in un contenitore con soluzione bloccante e incubare.
   • Eliminare la soluzione bloccante, sostituirla con una soluzione anticorpale e incubare.
   • Eliminare la soluzione anticorpale, lavare la membrana.
8. Seguire le indicazioni del produttore per il rilevamento chemiluminescente.

Northern Blot

Le Northern blot vengono utilizzate per determinare l’identità, la dimensione e l’abbondanza di specifiche sequenze di RNA. I protocolli Northern blot iniziano con l’isolamento dell’RNA e le tecniche di separazione variano a seconda delle dimensioni dell’RNA. I grandi RNA sono separati mediante elettroforesi su un gel di agarosio formaldeide o gel di agarosio gliossale, che impedisce la normale sbucciatura della base e mantiene l’RNA in uno stato denaturato. I piccoli RNA sono separati su un gel di poliacrilammide denaturante (urea). L’RNA viene quindi trasferito dal gel a una membrana di nylon che viene quindi incubata con una sonda di RNA, DNA o oligodeossinucleotide etichettata radioattivamente o non isotopicamente. La sonda non ibridata viene rimossa lavando con tampone. Le sonde radiomarcate vengono visualizzate con pellicola a raggi X e le sonde etichettate enzimaticamente vengono visualizzate con chemiluminescenza.

Northern blot protocol

1. RNA isolation
2. Elettroforesi:
   • Per un gel di agarosio formaldeide: preparare il gel e inserire il vassoio del gel nell’apparecchio. Riempire con tampone MOPS, caricare i campioni e includere un marcatore di peso molecolare. Eseguire il gel, quindi tagliare il gel prima di asciugare.
   • Per un gel di agarosio gliossale: preparare il gel e inserire il vassoio del gel nell’apparecchio. Riempire con tampone MOPS, preparare i campioni e caricare in pozzetti con scala RNA.
   • Per un gel di poliacrilammide denaturante: lanciare il gel e montarlo nell’unità di elettroforesi. Preparare i campioni, caricare nel gel, ed eseguire con TBE esecuzione buffer.
3. Trasferimento:
   • Per un gel di agarosio formaldeide o gel di agarosio gliossale: lavare il gel in SSC, quindi assemblare l’unità di trasferimento con il gel, la carta da filtro e la membrana in nylon. Al termine del trasferimento, posizionare la membrana in un cross-linker UV.
   • Per un gel di poliacrilammide denaturante: montare l’unità di trasferimento comprendente gel, carta da filtro e membrana in nylon assicurando che siano inondati di TBE. Quando il trasferimento è completo, posizionare la membrana in un cross-linker UV per fissare l’RNA alla membrana.
4. Pre-ibridazione (blocco):
   • Pre-ibridazione della membrana in soluzione di ibridazione.
5. Ibridazione:
   • Aggiungere la sonda alla soluzione di ibridazione e incubare.
   • Lavare la membrana in lavaggi a bassa rigidità per rimuovere la soluzione di ibridazione e la sonda non ibridata e lavaggi ad alta rigidità per rimuovere le molecole parzialmente ibridate.
   • Seguire le indicazioni del produttore per il rilevamento chemiluminescente.

Western Blot

Le western blot vengono utilizzate per determinare l’identità, la dimensione e l’abbondanza di proteine specifiche all’interno di un campione. Il protocollo western blot inizia con la preparazione del campione di lisato da colture tissutali o cellulari e la separazione su un gel di poliacrilammide tramite elettroforesi. Le proteine separate vengono quindi trasferite in una membrana di difluoruro di nitrocellulosa o polivinilidene (PVDF). La membrana viene incubata con un agente bloccante per prevenire il legame non specifico, seguito dall’incubazione con un anticorpo primario per legare la proteina di interesse. Esistono due metodi di rilevamento, diretto e indiretto. La rilevazione diretta (Figura 2) si basa su un anticorpo primario marcato, mentre la rilevazione indiretta richiede un anticorpo primario diretto contro la proteina bersaglio e un anticorpo secondario diretto contro la classe di immunoglobina o sottoclasse delle specie dell’anticorpo primario (Figura 3). I metodi di visualizzazione includono saggi colorimetrici in cui viene prodotto un precipitato colorato, chemiluminescenza e fluorescenza.

Protocollo Western blot

1. Preparare il lisato da colture cellulari o tessuti.
2. Preparazione del campione:
   • Determinare la concentrazione proteica di ciascun campione con un test di quantificazione delle proteine(es. Test di Bradford).
   • Aggiungi un volume uguale di 2X Laemmli sample buffer a ciascun campione.
   • Alcuni campioni potrebbero dover essere ridotti o denaturati, ciò si ottiene facendo bollire i campioni nel buffer.
3. Elettroforesi:
   • Preparare un gel SDS-PAGE, caricare campioni con marcatore di peso molecolare.
   • Eseguire il gel in esecuzione buffer.
4. Trasferimento:
   • Dopo elettroforesi, montare l’unità di trasferimento compreso il gel, PVDF o membrana nitrocellulosa, e carta da filtro.
   • Trasferire le proteine alla membrana con tampone di trasferimento.
5. Colorazione anticorpale (rilevamento indiretto):
   • Preparare il tampone di blocco e incubare la membrana per ridurre il legame non specifico.
   • Incubare la membrana con anticorpo primario diluito in tampone bloccante.
   • Lavare la membrana in TBST e incubare con anticorpo secondario coniugato diluito in tampone bloccante.
   • Lavare la membrana in TBST.
   • Seguire le indicazioni del produttore per il rilevamento chemiluminescente.