shRNA対siRNA

RNA干渉（RNAi）は、RNA分子が遺伝子発現を阻害するために使用される 典型的には、内因性ｍ ＲＮＡに相補的であり、細胞に導入されると標的ｍ ＲＮＡに結合する短いＲＮＡ分子が作製される。 標的ｍ ＲＮＡへの短いＲＮＡ分子の結合は、機能的に標的ｍ ＲＮＡを不活性化し、時には標的ｍ ＲＮＡの分解をもたらす。歴史的に、2つのタイプの短いRNA分子がRNAi用途に使用されてきた。

低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、典型的には、長さが２ ０〜２ ５ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡ分子である。 細胞内にトランスフェクトされると、siRNAは標的mRNAも細胞内で分解されるまで一過性に阻害する。 小さなヘアピンＲｎａ（ｓｈＲＮＡ）は、典型的には約８ ０塩基対の長さのＲＮＡの配列であり、ヘアピン構造を生成する内部ハイブリダイゼーションの領域を含む。 ｓｈＲＮＡ分子は細胞内で処理されてｓｉＲＮＡを形成し、これが次に遺伝子発現をノックダウンする。 ＳｈＲＮＡの利点は、それらがプラスミドベクターに組み込まれ、より長期的または安定な発現のためにゲノムＤＮＡに統合され、したがって標的ｍ ＲＮＡのより長いノッ

RNAポリメラーゼIIIプロモーターからのshrnaの効果的な発現

shrnaを含む小さなRnaは、RNAポリメラーゼIII(Pol III)で内因的に転写される。 したがって、shRNAの高発現を保証するために、Cellectaは、Pol III、U6およびH1プロモーターに特異的に結合するプロモーターを使用する。 Ｕ６およびＨ１プロモーターの両方は、それらの小さいサイズのために効果的にｓｈＲＮＡを発現しないＣＭＶおよびＥＦ１のようなＰｏｌ Ｉ Ｉプロモーターと比較して、多くの細胞型を越えて高レベルのｓｈＲＮＡを発現するのに十分に働く。 さらに、shMIRsを発現するために使用されるPol IIプロモーターは、U6およびH1がうまく機能するほとんどの細胞型では機能しない可能性があります。

レンチウイルスベクターは、ターゲットの永続的なノックダウンを可能にします

shRNAは安定して宿主細胞ゲノムに統合されるようになります。 細胞が分裂すると、shRNAは娘細胞に渡されます。 Shrnaの発現のためのレンチウイルスベクターを使用すると、細胞を複数回トランスフェクトする必要なく、永続的なノックダウンを提供します。 レンチウイルスベクターがどのように機能するかについての詳細は、レンチウイルスベクターシステムのページを参照してください。

shRNA設計の最適化

効果的なshrnaの設計は、効果的なRNAiノックダウンスクリーニングのために不可欠です。

効果的なShrnaの設計は、効果的なRNAi 最適な配列を選択することに加えて、shRNAの有効性に影響を与える多くの構造因子が存在する。 さらに、shRNAのステムループヘアピン構造は、ライブラリの構築と増幅のための問題を提起します。 代表的な品質のshRNAライブラリを作成するために、我々は我々のライブラリにshRNAインサートの効果的な最適化するための重要な努力を集中しています。 私たちは、最も効果的なshRNA配列を予測するための社内アルゴリズムを開発し、私たちのライブラリを構築する際に検証された配列の公開されたデータ また、ライブラリ構築のためのshRNAの構造を最適化しました。

shRNA構造変動を大規模に効率的に試験するために、レポーターアッセイに基づく高スループットshRNA有効性試験技術を開発しました。 標的遺伝子からのｃＤＮＡ断片または短いオリゴヌクレオチドへの３’融合を有するレポーター遺伝子（ＧＦＰのような）が、この標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ構築物の有効性をモニターするために効果的に使用され得ることが以前に実証された。 これらの知見に基づいて、我々は機能的shRNA構築物の同定のためのレンチウイルスレポーターベクターを開発した（図1）。 当社独自のshRNAテストレポーターベクターは、GFPレポーターの3’末端にH1プロモーターとターゲット配列の下流のshRNAテンプレートの両方のクローニングを可能にします。 この構築物が細胞に形質導入されると、H1プロモーターからの転写はshRNAを産生し、CMVプロモーターからの転写は機能的shrnaをスクリーニングするためのレポーターとし

ゲノムDNAとGFP標的レポーターのノックダウンのメカニズムに統合されたshRNA標的レンチウイルスレポーターコンストラ 機能性ｓｈＲＮＡ構築物で形質導入された細胞は、低いＧＦＰ ｍ ＲＮＡレベルを有するが、非機能性ｓｈＲＮＡは、高レベルのＧＦＰ ｍ ＲＮＡ発現を可能にする。

shRNAの構造を最適化するために、我々は150shrnaのshRNA検証ベクターにshRNAターゲットライブラリを構築し、各shRNAは文献に記載されている40の異なるデザインで構築

本発明者らは、この150x40bar-coded shRNA標的ライブラリーを形質導入したCHO-TRex細胞においてRNAiスクリーンを実施し、各shRNA構築物の表現（ライブラリーおよび形質導入された細胞内）およびノックダウン効率を測定した。

このスクリーニングからのいくつかの代表的なデータを以下に示します。

十の最高のデザインは、最高のターゲットノックダウン活性、同プールされたrnaiライブラリ内のshrnaを設計します。 レンチウイルスベクターでこれらの10の最高のデザインで構築された三つのp53shrnaのノックダウン効率は、さらにマウス線維芽細胞への形質導入後RT-PCR