Fem Pax-6 varianter Og deres uttrykksmønstre i blekksprut embryoer og voksen øye vev

vi utførte en enkelt 3′-RASE PCR For pygmy blekksprut Pax-6 genet (betegnet som IpPax-6) for å undersøke spleising varianter Og multiple loci Av Pax-6 i coleoid cephalopods. Vi fant at det ikke var flere loci i pygmy blekksprut, men vi identifiserte tre Pax-6 varianter av diskrete lengder. Forskjeller i aminosyresekvensene blant Disse Pax-6-variantene var begrenset til begrensede regioner. Derfor ble de antatt å være et resultat av alternative spleising hendelser av et enkelt locus. Vi validerte deretter tilstedeværelsen AV spleisingsvarianter ved HJELP AV RT-PCR, og vi fikk endelig fem typer spleisingsvarianter, inkludert en tilsynelatende ortolog av autentisk Pax-6 (Figur 1). Lengden og strukturen av autentisk IpPax-6 var lik De Av Pax – 6 gener funnet i andre blekksprut arter, Euprymna scolopes Og Loligo pealei15, 16. Autentisk IpPax-6 (authentic form, 499 aa) består av to uavhengige DNA-bindende domener, PD-og HD-domenene og Et C-terminal P / S / T – rikt domene (Pst), som er den dedikerte aktivatoren med et partnertransaktivatorprotein, som vist hos mange dyr (Figur 1). Både protein sekvens likhet og fylogenetisk treet bekreftet At IpPax-6 var en ortolog av fly ey Og virveldyr Pax-4/6 (Supplerende figur 1). De fire identifiserte varianter produserte proteiner med lengder forskjellig fra autentisk IpPax-6 (Figur 1).

for å utforske scenespesifikke uttrykk for blekksprut Pax-6 varianter, utførte VI Q-PCR for ulike vev og på ulike embryonale stadier ved hjelp av primere utformet for å målrette de ekstra eksonene Av IpPax-6 (Figur 2& Figur S2). Blekksprut egg viser epibolic gastrulation og direkte utvikling uten typiske bløtdyr larve stadier17. Embryonale øyne vises fra den eksterne epidermen til blastodisc og er differensierbare etter trinn 18, med retinal pigmentering som starter i trinn 20. Linsen ser ut som en gjennomsiktig pinnelignende struktur som er synlig for det blotte øye på trinn 25. Vi først utført Q-PCR utnytte primere målretting exon 2, som dekker alle fem varianter. Q-PCR-analysen viste at IpPax-6 ble uttrykt i trinn 16 før dannelsen av øyevesikler (Figur 2a). Uttrykksintensiteten til IpPax-6 ble gradvis oppregulert med utviklingen av blekksprutembryoen (Figur 2a), med øyebollet som viste de høyeste uttrykksintensitetene blant de testede vevene. Som observert hos de andre bilaterale dyrene, ble de autentiske og variantformene av IpPax-6 uttrykt ved markant deprimerte nivåer i muskelvevet. Vi brukte deretter primere som målretter mot varianter som mangler exon 4 (varianter 1 Og 3, Figur 2b). Primerne oppdaget varianter 1 og 3 ved lave nivåer i embryoene på stadium 16 og i øyebollvevet. Vi brukte også primere målretting varianter inkludert exon 6 (varianter 2 Og 3, Figur 2c). Q-PCR-analysen viste at varianter 2 og 3 ble uttrykt i øyebollene og optiske lobes samt i embryoer i trinn 16 og 25. Ettersom dannelsen av fotoreseptorceller og linsen begynner i embryoer i fase 25, kan varianter inkludert exon 6 bidra til øyeutvikling. Resultatene viser at uttrykket mønstre Av ippax-6 varianter skilte seg vesentlig fra den autentiske ippax-6.

FOR å skille hvilke varianter som er til stede i hvert trinn, utførte VI RT-PCR ved hjelp av primersett over exon grenser. Variant 1 ble ansett å være uttrykt i alle / noen embryonale stadier, men ikke i de voksne øynene (Supplerende figur 2). RT-PCR-analyse viste også at variant 4 var sterkt uttrykt i de voksne øynene, spesielt i netthinnen, men ikke i linsene (Supplerende figur 2a). Varianter 2 og 3 ble uttrykt på tvers av alle embryonale stadier og også i voksent vev (Supplerende figur 2b).

for å identifisere det vevsspesifikke uttrykket Av ippax-6 varianter, utførte vi in situ hybridisering ved HJELP AV RNA-prober designet for å binde spesifikt til hver variant (Figur 2d–G). RNA-sonden designet fra exon 2 mål alle fem varianter identifisert i denne studien. RNA-sonden designet fra ekson 4 bundet til autentisk form og til varianter 2 og 4. IpPax-6 ble funnet å være lokalisert i hjerneområdet, inkludert dorsal basal lobe, overlegen frontal lobe, peduncle/olfactory lobes og optic lobes (Figur 2d-G), som beskrevet I Hartmann et al.18 vevet utenfor netthinnen (kanskje tilsvarende det fremtidige iridoforlaget) uttrykte også tydelig ippax – 6 i trinn 22(Figur 2D OG 2D’). IpPax – 6-uttrykk ble observert i dette laget til trinn 25. In situ hybridisering utnytte sonden målretting exon 4 antydet at varianter 2 og 4 hadde lignende uttrykksmønstre i hjernen, Men ikke i øynene (Figur 2e). Dette funnet antyder at varianter 1 og 3 (mangler exon 4) er oppregulert i ytre lag av øynene. Disse konsekvensene innebærer at hver IpPax – 6-variant reguleres uavhengig av prosessene for øyedannelse.

Exon-intronstruktur Av Pax-6 i andre blæksprutte / bløtdyr

vi undersøkte om denne typen alternativ spleising bare ble oppnådd i koleoid blæksprutte. Ved Å bruke RT-PCR-analyse På Japansk spydsprutsprut (Loligo bleekeri) embryonale Rna, fant vi tre typer mrna muligens avledet fra alternativ spleising (exon 4 hoppe, exon 3 innsetting og exon 6 innsetting)i øynene (Figur 3a, B). De innsatte eksonene 3 og 6 kodede 20 og 40 aminosyrer, henholdsvis, mens de hoppet over ekson 4 kodede 51 aminosyrer. For å undersøke tilstedeværelsen av lignende alternativ spleising i andre bløtdyrgenomer, undersøkte vi exon-intronstrukturer Av Pax-6 i owl limpet og pearl oyster. Den komplette genom sekvens av ugle limpet (Lottia gigantea, hentet FRA jgi genome portal Lotgi V1.0, E_gw1.86.103.1)19 og av perle østers (Pinctada fucata, hentet FRA Oist Marine Genomics Unit genome browser P. fucata_ver1.0, transkripsjon: pfu_aug1.0_8418.1_67856.t1, stillas8418.1) 20 viste at bløtdyr Pax-6 har fem eksoner. Exon 4 i blekksprut ble konservert på tvers av bløtdyr arter testet. Eksoner 3 og 5 ble imidlertid ikke funnet i pearl oyster Pax – 6-genet. Dermed fant vi at variant former 2 og 4 har blitt kjøpt i coleoid cephalopod avstamning (Figur 1).

så vidt vi vet, er vår studie Den første til å rapportere in-frame spleising varianter av blekksprut Pax-6 som ble uttrykt forskjellig i henhold til embryonale scenen. Tidligere studier isolerte diskrete typer spleisingsvarianter som hadde mistet den n-terminale halvdelen AV PD-domenet i andre blekksprutarter15, 18, men disse variantene viste ikke romtidsforskjeller i uttrykk. Vår studie foreslo også at mekanismene som ligger til grunn for oppkjøpet av variasjoner I pax-6 transkripsjoner ved alternativ spleising har blitt unikt ervervet i coleoid cephalopod avstamning, som de lavere bløtdyr, slik som muslinger, ikke har en tilsvarende ekson-lignende fragment i deres genomer.

funksjon av blekksprut Pax-6 varianter og deres antatte rolle i øyeutvikling

tillegg og sletting av et aminosyrefragment kodet i de alternativt brukte eksonene forventes å forårsake strukturelle endringer i ippax-6 proteinvarianter, noe som kan endre deres funksjon i utviklingsprosessen. To av varianter (varianter 1 og 3) mangler en 153mer midt i autentisk Pax-6 og halvparten AV HD (Figur 1). For å undersøke om slettingen påvirker deres funksjonelle egenskaper, utførte vi tredimensjonale (3D) strukturelle spådommer av proteinene basert på komparativ modellering. De antatte 3d-strukturer Av HDs av autentisk ippax-6 og varianten mangler segmentet kodet av exon 3 ble konstruert. Malstrukturen ble identifisert VED DNA-bundet form slik at vi kunne forutsi strukturen til IpPax-6 og varianten I DNA-bundet form. Den antatte 3d-strukturen til den autentiske formen var rimelig godt modellert; kjernerester, Nemlig Phe på sløyfen før DEN første helixen AV HD, Leu på den første helixen, Leu på den andre helixen Og Trp og Phe på den tredje helixen av modellstrukturen, ble konservert og DE tre helixene AV HD var tilsynelatende tett pakket inn i hverandre (Figur 3C). Resterne som er viktige FOR DNA-binding, nemlig to argrester ved N-terminalarmen og polare rester på overflaten av den tredje helixen, ble plassert rimelig nær DNA-grensesnittet (Figur 3C, D). Imidlertid presenterte den antatte 3d-strukturen til varianten en rekke problematiske problemer. I den modellerte strukturen ble tapet av regionen kodet av exon 3, som koder For Den N-terminale delen av den første helixen, kompensert av 15 rester kodet i exon 2. Således varierte aminosyresekvensene av de autentiske og variantformene bare i regionen som inneholdt de 15 rester Av Den n-terminale siden. Denne forskjellen økte imidlertid den strukturelle energien til varianten betydelig og tilsynelatende destabiliserte den samlede strukturen. Denne ustabiliteten kan skyldes mangel På Phe på løkken før den første helixen og Leu på den første helixen. Disse komponentene er tydeligvis viktig for pakking de tre helikser. I tillegg manglet to argrester ved N-terminalsløyfen som binder SEG TIL DNA-basene i den mindre sporet i autentisk form i varianten. Disse problemene i stabilitet og DNA-binding i varianten tyder sterkt på AT hd av varianten er ustabil og at domenet har liten bindingsaffinitet FOR DNA(Figur 3D og 3D’). Mangelen på en stabil HS tyder videre på at varianter 1 og 3 har FORSKJELLIGE DNA-målsteder fra autentiske ippax-6 i blekksprutarter.

To varianter (varianter 2 og 3) viste også en 120 mer innsetting i PST-domenet (Figur 1). Den innsatte sekvensen ble funnet å være spesifikk for blekksprut(Figur 2). Denne innsettingen kan endre transaktiveringsaktivitetene TIL pst-domenet. Variant 4 viste en unik innsetting (57 mer) mellom PD og HD. Motif-programmet (http://www.genome.jp/tools/motif/) fant ingen kjente domener eller signaturer i den innsatte sekvensen. Denne innsetting forlenger en linker mellom PD og HD domener.