HPV / p16 positiv og negativ HNSCC viser forskjeller i nodal involvering
vi bestemte HPV-og p16-statusen til 241 PASIENTER behandlet med (kjemo) stråling (c)RT. De humane tumorprøver ble anskaffet i henhold til protokoller godkjent av Universitetssykehusets Etiske styre Leuven (Leuven, Belgia) og underforstått samtykke fra alle pasientene ble oppnådd. Kliniske data ble hentet fra pasientdiagrammer og gjennomsnittlig oppfølgingstid var 4,19 år. HPV-positive pasienter ble karakterisert ved lavere T-stadier med 45% (26 av 58; p = 0,025) AV HPV-positive pasienter som viste t1/2-trinns svulster, mens dette var 29% (51 av 175; p = 0,025) I HPV-negativ gruppe. VIDERE VISTE HPV – positive svulster signifikant høyere (p = 0.014) nodal involvering med 72% (42 av 58) AV HPV-positive pasienter som viste n2 / N3 svulster, mens dette bare var 54% (95 av 175) I HPV-negative gruppen. Selv om forholdet mellom p16-status og n-stadium ikke var signifikant, ble det sett en trend mot høyere nodal involvering og p16 positivitet. Sekstitre% av p16-positive pasienter viste n2 / N3-svulster, mens dette bare var 54% i den p16-negative gruppen (Tabell 1). Disse resultatene er i samsvar med andre studier, og viser AT HPV-positive HNSCC-pasienter har høyere N-og lavere t-stadier .
som forventet resulterte lave t-stadier i bedre fjernkontrollrate (DC) med 5-års kontrollrate på 83% og 70% (p = 0,04) For T1 / t2 og t3 / 4 svulster henholdsvis (tilleggsfil 1: figur s1a). N2 / 3 svulster (5 års DC 70%; p = 0,02) viste en høyere risiko for fjern svikt sammenlignet Med n0/1 svulster (5 års DC rate 85%; p = 0,02) (Tilleggsfil 1: Figur S1b). Ingen statistisk signifikant forskjell ble sett i DC-frekvens mellom HPV positiv og negativ sykdom (5-årig DC-frekvens på henholdsvis 82% og 5-årig DC-frekvens på 72%; p = 0,20) (Tilleggsfil 1: Figur S1c). Selv om det ikke er signifikant, tyder denne 10% forskjellen I DC-priser på påvirkning av viruset utover lokal tumorkontroll. Videre indikerer det tilstedeværelsen av forskjellige spredningsmønstre MELLOM HPV positiv og negativ HNSCC.
p16 undertrykker invasjonen og migreringskapasitet AV HPV positiv HNSCC
for å undersøke den molekylære mekanismen bak disse potensielle forskjeller sett i metastase i vår pasient kohort, vi vurdert in vitro migrasjon og invasjon kapasitet AV HNSCC celler. HPV / p16-positive SCC154-og SCC104-celler viste en signifikant lavere migrasjonsrate sammenlignet med HPV/p16-negative sqd9 -, CAL27-og SC263-celler (Fig . 1a). I samsvar MED migrasjonsanalysen viste HPV/p16-positive celler redusert invasjonsevne sammenlignet MED HPV/p16-negative celler (Fig. 1b).
p16 represses the in vitro invasion and migration capacity of HPV positive HNSCC. a Migration capacity of HPV negative cells (SQD9, CAL27 and SC263) and HPV positive cells (SCC154, SCC104). b Invasion capacity of HPV negative SQD9 cells and HPV positive SCC154 cells. c Migration capacity of HPV positive SCC154 cells treated with shRNA for p16 (shp16) and control (shluc). D Invasjonskapasitet FOR HPV-positive SCC154-celler behandlet med shRNA for p16 (shp16) og kontroll (shluc). (a-d) resultatet er vist som gjennomsnittlig ± SEM av tre forsøk, og p-verdier beregnes ved tosidig t-test
tumorsuppressoren p16 er en velkjent cellesyklusregulator og en god surrogatmarkør for HPV-positiv HNSCC . Videre tilskriver nyere data en bredere rolle for p16, inkludert en rolle i migrasjon og undertrykkelse av angiogenese . Derfor undersøkte vi også innflytelsen av p16 på migrasjons-og invasjonskapasiteten TIL HPV-positive SCC154-celler manipulert med kort hårnål RNA (shRNA) for p16 (shp16) og kontroll shRNA (shluc). Nedregulering av p16-uttrykk økte migrasjons-og invasjonskapasiteten TIL scc154-cellene (Fig. 1c og d). Disse dataene bekrefter tilstedeværelsen av forskjeller i spredningsmønstre MELLOM HPV positiv og negativ HNSCC og foreslår en aktiv rolle av p16 i metastatisk kaskade.
p16 undertrykker migrasjon og invasjon gjennom angiogenese i HPV-positiv hnscc
det er velkjent at angiogenese, som aktivt opprettholdes i kreftceller av proangiogene faktorer som vaskulær endotelial vekstfaktor A (VEGFA), er en kanal for spredning og metastase av kreftceller og fremmer aggressiv tumorprogresjon . Videre er den negative korrelasjonen MELLOM HPV / p16 og VEGFA tidligere beskrevet I HNSCC . Derfor vurderte vi forholdet MELLOM HPV, p16 og VEGFA i vår pasientkohort. HPV-positive pasienter viste signifikant lavere VEGFA-uttrykk med 54% (28 av 51) av pasientene som viste ingen ELLER lav VEGFA-uttrykk sammenlignet med 32% (53 av 161) I HPV-negativ gruppe (Tabell 2). Selv om den negative korrelasjonen MELLOM VEGFA og p16 var mindre uttalt, ble det sett en trend til signifikans (Tabell 2).
Vi undersøkte videre forholdet mellom angiogenese og p16 med in vivo xenografter injisert MED SCC154 HPV-positive celler manipulert med shp16 eller shluc. Et høyere antall blodkar ble påvist i mustumorer med lavt p16-uttrykk sammenlignet med kontrolltumorer (Fig . 2a). Videre resulterte økningen i vaskularisering i lavere nekrose, høyere antall mitotiske celler og vekstfordel ved shp16-ekspresjonstumorer (Tilleggsfil 2: Figur S2A-C). Vi kunne ikke verifisere involvering av p16 i undertrykkelse av metastase in vivo på grunn av fravær av en metastatisk dyremodell. Vekstfordelen og økt vaskularisering sett i shp16 mustumorer kan imidlertid forklare den hyppige forekomsten av avanserte t-stadier hos HPV-negative HNSCC-pasienter.
Dobbel rolle av p16 i formidling AV HNSCC. En blodkardannelse I SCC154 shp16 og SCC154 shluc xenograft musemodeller vurdert VED CD31-farging( over grafen); n = 5. B Gjennomsnittlig antall lymfatiske kardannelse I SCC154 shp16-og SCC154 shluc xenograft-musemodeller vurdert VED LYVE – 1-farging( over grafen); n = 5. c gjennomsnittlig score på alpha4 beta1 integrin farging I SCC154 shp16 og SCC154 shluc mus xenograft modeller; n = 5. d Average score of alpha4 beta1 integrin staining in HPV positive SCC154 (n = 7) and HPV negative SQD9 (n = 10) mouse xenograft models. a-d P-verdier beregnes ved tosidig t-test
p16 stimulerer lymphangiogenese og nodal spredning i HPV-positiv HNSCC
disse resultatene forklarer fortsatt ikke forekomsten av lignende fjerne tilbakefallsrater hos HPV / p16 positive og negative hnscc-pasienter og forklarer absolutt ikke den svært signifikante sammenhengen MELLOM HPV-VIRUSET og HPV-VIRUSET .positivitet og Nodal engasjement beskrevet i våre og flere andre studier. DETTE er spesielt viktig siden det impliserer tilstedeværelsen av et høyt lokalt metastatisk potensial i HPV-positiv HNSCC. Interessant lymphangiogenese, som angiogenese, fremmer tumormetastase ved å indusere veksten av nye lymfekar i svulsten og ved å øke cellehandel til lymfeknuter. Videre er økt lymfatisk fartøyets tetthet i svulster forbundet med økt metastase til lymfeknuter. . Derfor vurderte vi lymfatisk kardannelse ved homolog lymfatisk kar hyaluronan (LYVE-1) immunostaende i shluc og shp16 mustumorer. Vi fant at p16 suppresjon resulterte i lavere lymfekar tetthet I HPV / p16 positive xenografts tyder på en dobbel rolle av p16 i metastase (Fig. 2b).For å forstå funksjonen til p16 fokuserte vi på integriner da disse proteinene er akseptert som viktige regulatorer av angiogenese og lymphangiogenese . Videre er bindingen av p16 til integriner og tap av cellespredning tidligere dokumentert . Integriner som alpha4 beta1 er viktige modulatorer av lymphangiogenese . Derfor vurderte vi tilstedeværelsen av alpha4 beta1 integrin I scc154 shluc og SCC154 shp16 mustumorer. Although not statistically significant (p = 0.09), shluc tumors showed a higher percentage of integrin compared to shp16 tumors (Fig. 2c). In line with SCC154 shRNA xenografts, tumors from HPV/p16 positive SCC154 xenografts showed higher percentage of alpha4 beta 1 integrin compared to tumors from HPV/p16 negative SQD9 xenografts (Fig. 2d).