Bakteriofager, også kalt fager, er virus som spesifikt infiserer bakterier, og vi kan bekrefte deres tilstedeværelse og kvantifisere dem ved hjelp av et verktøy kalt plakkanalysen. Bakteriofager infiserer deres følsomme verter ved først å feste seg til bakteriell cellevegg og injisere deres genetiske materiale. Deretter kaprer de cellens biosyntetiske maskineri for å replikere DERES DNA og produsere mange avkomfagepartikler, som de deretter frigjør ved å lysere og drepe vertscellen.denne lytiske aktiviteten er grunnlaget for en mye brukt fagopptelling teknikk kjent som plaque assay eller double agar layer assay. Her fremstilles en bakteriofagblanding først i en smeltet næringsbuljong som inneholder lav konsentrasjon agar. Alle bakterier som brukes i blandingen, skal være i live og aktivt dele seg i loggfasen av veksten, noe som vil sikre at en stor andel av bakteriene er levedyktige og i stand til å danne en tett plen rundt plakkene. Deretter spres denne smeltede bakteriefag agarblandingen over et mer solidt, konsentrert agar næringsmedium som allerede er størknet på En Petriskål. Ved inkubasjon ved romtemperatur størkner den lave konsentrasjonen agar-fag-bakteriebuljongen også for å danne et mykt agaroverlegg.her kan bakteriecellene utlede ytterligere næringsstoffer fra bunnlaget og bør raskt multiplisere for å produsere en sammenflytende plen av bakterier. Men da fagpartikler også er tilstede i det myke laget, vil disse infisere og replikere deres genetiske materiale i bakteriene, som kulminerer i cellelyse, som frigjør flere avkom. Disse fagavkom infiserer deretter nabocellene, da den halvfaste tilstanden til bakteriefaglaget begrenser bevegelsen til mer fjernt lokaliserte vertsceller. Denne syklusen av infeksjon og lysis fortsetter over flere runder, og dreper et stort antall bakterier i et lokalisert område. Effekten av nabocellene blir ødelagt, er å produsere en enkelt sirkulær klar sone, kalt en plakett, som kan ses med det blotte øye, effektivt forsterker bakteriens lytiske aktivitet av fag og muliggjør oppregning.

antallet plakk på En Petriskål refereres til Som Plakkdannende Enheter, Eller Pfuer, og dersom den opprinnelige bakteriofagkonsentrasjonen var tilstrekkelig fortynnet, bør den direkte tilsvare antallet infeksiøse fagpartikler i den opprinnelige prøven. Denne teknikken kan også brukes til karakterisering av plakkmorfologi, for å hjelpe til med identifisering av fagtyper, eller for å isolere fagmutanter. I dette laboratoriet lærer du hvordan du utfører plakkanalysen for å oppregne fag, ved hjelp Av T7-fag Av E. coli som et eksempel.

identifiser Først et egnet medium for dyrking av vertsbakterieceller og bakteriofagen. Her ble lysogenibuljong, ELLER LB-medium, brukt til å dyrke E. coli og T7-fag. Deretter tar du tre rene glassflasker og merker dem med media, navn, og deretter den første SOM LB-Buljong, den andre SOM LB-Bunn Agar, og den tredje SOM LB-Topp Agar. Nå veier ut fire gram pre-formulert LB pulver i tre sett og deretter overføre ett sett av veid tørket media i hver flaske. Tilsett 200 ml vann til den første flasken. Bland innholdet med en magnetisk rørestang.

deretter, ved hjelp av en pH-meter og konstant omrøring, bringe den endelige pH til 7,4 ved tilsetning av natriumhydroksyd eller saltsyre. Gjenta vanntilsetning og pH-justering for de andre to gjenværende flasker, også. Nå veier du ut tre gram agarpulver og legger det til den andre flasken for å lage en 1,5% bunn agar. Til slutt veier 1. 2 gram agar og legge den til den tredje flasken for å gjøre .6% LB topp agar. Kjøttkraft tilstanden i flaske man trenger ikke en agar tillegg. Cap flasken halvtett og steriliser deretter mediet ved autoklavering ved 121 grader Celsius i 20 minutter. Når du er ferdig, fjern medieflaskene fra autoklaven og vri flaskehettene umiddelbart for å lukke dem helt for å unngå forurensning. Hold LB-Buljong Og LB-Top Agar media på benken for senere bruk. Plasser LB-Bunn Agar avkjøles i et vannbad som er forhåndsinnstilt til ca 45 grader Celsius.

NÅR LB-Bunn agar når omtrent 45 grader Celsius, overfør den til arbeidsbenken. Steriliser deretter arbeidsområdet ved hjelp av 70 % etenol. Deretter tilsettes 450 mikroliter sterilt ett molært kalsiumklorid til smeltet bunnagar for å få en endelig konsentrasjon på 2.25 millimolar. Vri forsiktig flasken for å blande. Deretter setter du ut syv rene Petriskåler. Merk hver tallerken på bunnen med medienavnet og forberedelsesdatoen. Hell deretter 15 milliliter av bunnen agar i hver av de syv Petriskålene. La platene stille i noen timer eller over natten ved romtemperatur. Når de er innstilt, kan kulturplatene lagres ved fire grader Celsius i flere dager om nødvendig, opp ned for å minimere kondens. Overfør Petriskålene fra fire grader Celsius kjøleskap til en 37 grader Celsius inkubator en time før analysen.

dagen før analysen skal preformes, Bør E. coli dyrkes. Her ble 10 mikroliter Av e. coli-kultur inokulert i 10 ml LB-Buljong. Plasser bakteriene til å vokse over natten i en ristende inkubator satt til 37 grader Celsius ved 160 RPM. Deretter, på dagen for analysen, fjern bakteriekulturen fra inkubatoren. Seed en fersk 10 milliliter frisk LB kjøttkraft med 0,5 milliliter av overnattingskulturen. Plasser disse cellene for å vokse til en ristende inkubator satt til 37 grader Celsius ved 160 RPM. Deretter bruker du et spektrofotometer for å sjekke når denne kulturen når loggfasevekst, angitt med en optisk tetthet på 0,5 til 0,7. NÅR OD når dette nivået, stopp inkubasjonen ved å overføre cellekulturen til benken. De er nå klare til å brukes til fagoverleggsanalyse.

Fagtitere kan variere eksponentielt på tvers av ulike fagtyper og prøver. Så for å telle dem effektivt, bør de fortynnes for å generere et bredt spekter av fagkonsentrasjoner. På analysedagen genererer du en serie fagfortynninger som spenner fra en tiendedel til en million konsentrasjon, etter en 10-ganger fortynningsteknikk. For å oppnå statistisk signifikante og nøyaktige data, utfør seriell fortynning i tre eksemplarer.

deretter smelter den størknede LB-top agar ved hjelp av en mikrobølgeovn. Deretter plasserer den i et vannbad som er forhåndsinnstilt ved 45 grader Celsius i en time. Etter en time samler Du Petriskålene som inneholder bunnagarlaget fra inkubatoren. Merk platene med fagkonsentrasjon og analysedato. Deretter setter du ut syv rene reagensrør. Merk hvert reagensrør med seriell fagfortynningsnummer og betegne en som kontroll.

NÅR LB-top agar når 45 grader Celsius, overfør den til arbeidsbenken. Legg nå 450 mikroliter av ett molar kalsiumklorid til 200 milliliter agar for å få en endelig konsentrasjon på 2,25 millimolar. Vri forsiktig flasken for å blande. Deretter tilsettes 35 milliliter LB-top agar og fire milliliter bakteriell suspensjon til et sterilt konisk rør. Forsiktig virvle å fordele cellene, men unngå risting for å hindre skumming.

nå, aliquot fem milliliter av denne bakterie-topp agar blanding til hver av de syv reagensrørene. Deretter overfører 100 mikroliter av de serielt fortynnede bakteriofagprøver og kontrollmedier, som bare skal være medier uten bakteriofag, til de respektfullt merkede reagensrørene. Vri blandingen forsiktig for å sikre riktig blanding. Overfør forsiktig fem milliliter bakteriofagblanding på den respektive Petri-platen. Fordel blandingen jevnt over hele overflaten ved å vri Petri-platen forsiktig.

når Alle petri-platene er lagdelt med blandingen, tillat størkning av topplaget ved å inkubere ved romtemperatur i 15 minutter. Etter å ha fullført disse trinnene, gjenta prosessen for det andre og deretter det tredje settet Av Petriskålene ved å bruke de resterende to settene med fagfortynninger. Forsegl hver tallerken med parafilm og inkuber ved romtemperatur i 15 minutter. Plasser kulturplaten opp ned ved en passende temperatur i 24 timer eller til plakkene utvikles. Her ble plater plassert i en 37 grader Celsius inkubator i en dag, en stimulerende veksttilstand For E. coli og t7 fag.

Plaques vil vises etter en til fem dager med inkubasjon, avhengig av bakteriearter, inkubasjonsforhold og valg av medium. Her var plakkene synlige etter en dag med inkubasjon ved 37 grader Celsius. Begynn med å sjekke platene merket kontroll og sikre at ingen plakk ble dannet i disse platene, da dette vil indikere viral forurensning. For å bestemme fagtiter i den opprinnelige prøven, start med platene som inneholder den mest fortynnede fagprøven først og tell plakkene uten å fjerne dekslene, merk dem for å indikere hvilke som allerede er talt. Gjenta tellingen for hver plate i hvert sett. Noen plater kan ha for mange eller for få plaketter som skal telles. Vurder 10 til 150 som et ideelt plakktall.

generer Deretter en tabell som viser plakknummerverdiene for de forskjellige fortynningene og replikatene. Deretter beregner du gjennomsnittlige plakkantallverdier for fortynningsplatene som inneholdt det ideelle antallet plakkantall. I dette eksemplet var disse gjennomsnittlig antall plakk dannet i 10 til minus tre og 10 til minus fire fortynningsplater. Juster nå for fagfortynningsfaktor ved å dele de oppnådde gjennomsnittlige plakkverdiene med de respektive fagfortynningsfaktorene. Her ble gjennomsnittlig antall plakk dannet til 10 til minus tre og 10 til minus fire fortynningsplater delt av deres respektive fortynningsfaktorer for å oppnå antall plakkdannende enheter, Eller Pfuer, i 100 mikroliter fagblanding. For å konvertere verdien til PFU per milliliter, multipliser de genererte verdiene med 10, da bare 100 mikroliter av fagfortynningsblanding ble brukt under bakteriofagoverleggspreparasjonstrinnet, noe som ga en ekstra fortynningsfaktor på 10. Til slutt beregner du gjennomsnittet av verdiene som er oppnådd fra de forskjellige fortynningsplatene. Dette vil gi gjennomsnittlig Antall Pfuer per milliliter. Antall Pfuer tilsvarer antall infeksiøse fagpartikler i den opprinnelige prøven.