shRNA versus siRNA

RNA interferens (RNAi) er en biologisk prosess DER RNA molekyler brukes til å hemme genuttrykk. Vanligvis opprettes korte rna-molekyler som er komplementære til endogen mRNA, og når de innføres i celler, binder de seg til målet mRNA. Binding av det korte rna-molekylet til målet mRNA inaktiverer funksjonelt målet mRNA og fører noen ganger til nedbrytning av målet mRNA.Historisk sett har to typer korte rna-molekyler blitt brukt i RNAi-applikasjoner. Små forstyrrende RNA (siRNA) er vanligvis dobbeltstrengede rna-molekyler, 20-25 nukleotider i lengde. Når transfisert til celler, siRNA hemme målet mRNA forbigående inntil de er også degradert i cellen. Små hårnål Rna (shRNA) er sekvenser AV RNA, typisk ca 80 basepar i lengde, som inkluderer en region av intern hybridisering som skaper en hårnål struktur. shRNA molekyler behandles i cellen for å danne siRNA som i sin tur slå ned genuttrykk. Fordelen med shRNA er at de kan bli innlemmet i plasmid vektorer og integrert i genomisk DNA for lengre sikt eller stabilt uttrykk, og dermed lengre knockdown av målet mRNA.

Effektiv Ekspresjon Av shrna fra Rna-Polymerase III Promotorer

Små Rna inkludert shrna transkriberes endogent med RNA-Polymerase III (Pol III). Dette er forskjellig fra cDNAs som transkriberes ved HJELP AV RNA-polymerase II. Derfor, for å garantere høyt uttrykk for shRNAs, Bruker Cellecta promotorer som spesifikt binder Pol III, U6 og H1-promotorene. Både U6-og H1-promotørene fungerer godt for å uttrykke høye nivåer av shRNAacross mange celletyper, sammenlignet Med Pol II-promotorer som CMV OG EF1, som ikke uttrykker shRNAs så effektivt på grunn av deres lille størrelse. I Tillegg Kan Pol II-promotorer som brukes til å uttrykke shmirer, ikke fungere i de fleste celletyper, Hvor U6 og H1 fungerer bra.

Lentivirale Vektorer Muliggjør Permanent Knockdown Av Mål

shRNA blir stabilt integrert i vertscellegenomet. Når cellene deler seg, overføres shRNA til datterceller. Bruk av lentivirale vektorer for uttrykk for shRNAs gir permanent knockdown uten å måtte transfisere cellene flere ganger. For å finne ut mer om hvordan lentivirale vektorer fungerer, se vår lentivirale vektorsystemside.

Optimalisering av shRNA Design

Designe effektive shRNAs er avgjørende for effektiv rnai knockdown screening. I tillegg til å velge den optimale sekvensen, er det en rekke strukturelle faktorer som påvirker shRNA-effekten. I tillegg utgjør stem-loop hårnål struktur av shRNA problemer for biblioteket konstruksjon og forsterkning. For å skape representative kvalitet shRNA biblioteker, har vi fokusert betydelig innsats for å optimalisere effektiv av shRNA setter inn i våre biblioteker. Vi har utviklet en egen algoritme for å forutsi de mest effektive shRNA-sekvensene, og kombinere dette med publiserte data fra validerte sekvenser når vi bygger våre biblioteker. Vi har også optimalisert strukturen av shRNA for bibliotek konstruksjon.For å effektivt teste shrna struktur variasjoner på en stor skala, utviklet vi en høy gjennomstrømning shRNA effekt testing teknologi basert på en reporter analyse. Det ble tidligere vist at et reportergen (SOM GFP) med en 3′ – fusjon til et cDNA-fragment eller kort oligonukleotid fra et målgen effektivt kunne brukes til å overvåke effekten av siRNA og shRNA-konstruksjoner mot dette målgenet. Basert på disse funnene utviklet vi en lentiviral reportervektor for identifisering av funksjonelle shRNA-konstruksjoner (Figur 1). Vår proprietære shRNA testing reporter vektor tillater kloning av både shRNA mal nedstrøms Av H1 promoter og målet sekvenser på 3 ‘ slutten AV GFP reporter. Når denne konstruksjonen transduseres til celler, produserer transkripsjon Fra H1-promotoren shRNA, mens transkripsjon fra CMV-promotoren genererer ET gfp-sense-mål mRNA-fusjonsutskrift som kan brukes som reporter for screening av funksjonelle shrnaer.

Kart over shRNA-target lentiviral reporter konstruere integrert i genomisk DNA og mekanisme for knockdown AV GFP-target reporter. Cellene transdusert med funksjonelle shRNA-konstruksjoner vil ha lave GFP mRNA-nivåer, mens ikke-funksjonelle shrna tillater et høyt NIVÅ AV GFP mRNA-uttrykk.for å optimalisere strukturen til shRNA konstruerte vi et shrna-målbibliotek i shrna-valideringsvektoren for 150 shrna, med hver shRNA konstruert i 40 forskjellige design beskrevet i litteraturen.Vi utførte rnai-skjermer I CHO-TRex-celler transdusert med dette 150×40 barkodede shRNA-Målbiblioteket og målt representasjon (i biblioteket og transduserte celler) og knockdown-effektiviteten til hver shRNA-konstruksjon. Noen representative data fra denne screeningen er vist nedenfor.

de ti beste design ble valgt basert på de som har den høyeste målet knockdown aktivitet, lik forsterkning effektivitet av samme design samlet oligonukleotider, og lik representasjon av samme design shrnas i samlet rnai biblioteker. Knockdown effektiviteten av tre p53 shRNAs konstruert med disse 10 beste design i en lentiviral vektor ble videre analysert VED RT-PCR etter transduksjon i mus fibroblast celler.