Abstract

Eyebright, Euphrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae), er en medisinsk plante som tradisjonelt brukes i Europa for behandling av ulike helsesykdommer, spesielt som øyevask for å behandle øyesykdommer som konjunktivitt og blefaritt som kan være forbundet med bakterielle infeksjoner. Noen Euphrasia-arter har tidligere blitt rapportert å inneholde essensiell olje. Imidlertid er sammensetningen og bioaktiviteten Til e. rostkoviana olje ukjent. Derfor undersøkte vi i denne studien den kjemiske sammensetningen og antimikrobielle aktiviteten til eyebright essensiell olje mot noen organismer forbundet med øyeinfeksjoner: Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, s. epidermidis, Pseudomonas aeruginosa og Candida albicans. GC-MS analyse viste mer enn 70 bestanddeler, med n-heksadekansyre (18,47%) som hovedbestanddel etterfulgt av tymol (7,97%), myristinsyre (4,71%), linalool (4,65%) og anetol (4,09%). Den essensielle oljen viste antimikrobiell effekt mot alle organismer testet med unntak Av p. aeruginosa. Den beste aktiviteten ble observert mot Alle Gram-positive bakterier som ble testet med minimum hemmende konsentrasjoner på 512 µ / mL. Dette er den første rapporten om kjemisk sammensetning av e. rostkoviana essensiell olje og dens antimikrobielle aktivitet.

1. Innledning

Eyebright, Euphrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae), har blitt brukt i europa i århundrer som en tradisjonell medisin for behandling av ulike sykdommer. Dekoksjoner og infusjoner av blomstrende luftdeler brukes mot tørr hoste, heshet, symptomatisk behandling av kulde, øreverk og hodepine, høfeber, purulent hudlesjon eller katarralsykdommer i tarmkanalen, men spesielt som øyevask for å behandle og forebygge øyesykdommer som konjunktivitt, blefaritt, øyet tretthet, purulent okulær betennelse og sties . Bruken av eyebright te har også blitt rapportert i etnoveterinærmedisin for ku øyeinfeksjonsbehandling . Til tross for århundrer med tradisjonell bruk for behandling av øyesykdommer, har det vært bare en prospektiv kohortforsøk utført som bekrefter effekten Av Euphrasia øyedråper ved behandling av konjunktivitt og en enkelt klinisk studie som undersøker effekten av lokal bruk av øyedråper på antibiotikaforbruk hos nyfødte . Videre, til de siste rapportene om anticandidal og antibakteriell aktivitet av Noen Euphrasia-ekstrakter, har spekteret av antimikrobiell virkning vært helt ukjent.

den terapeutiske effekten Av E. rostkoviana kan tilskrives hovedsakelig sin antioksidant, antiinflammatorisk og antimikrobiell aktivitet . Blant forbindelsene som tidligere er identifisert I e. rostkoviana-ekstrakter, kan apigenin, luteolin, kaempferol, quercetin, koffeinsyre, kumarinsyre og rosmarinsyre være ansvarlig for den antimikrobielle virkningen. Selv om tilstedeværelsen av essensiell olje (EO) i e. officinalis L. og E. stricta Kunt tidligere er rapportert, er sammensetningen og bioaktiviteten Til e. rostkoviana EO ukjent. Derfor undersøkte vi i denne studien den kjemiske sammensetningen OG antimikrobielle aktiviteten til eyebright EO mot panelet av tre Gram-positive bakterier (Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus og s. epidermidis) og tre Gram-negative bakterier (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae og Pseudomonas aeruginosa) og en gjær (Candida albicans), organismer som ofte er forbundet med øyeinfeksjoner.

2. Materiale og Metoder

2.1. Kjemikalier og Plantemateriale

de autentiske standardene borneol, kamfer, carvacrol, carvone, caryophyllene, p-cymene, estragol, eucalyptol, limonene, linalool, mentol, menthone, β-myrcen, γ-terpinen og tymol for identifikasjon AV eo-komponenter samt kontrollantibiotika ciprofloxacin og tioconazol ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Praha, tsjekkia). Heksan (Merck, Praha, tsjekkia), dimetylsulfoksid (DMSO) (Lach-Ner, neratovice, tsjekkia) Og Tween 80 (Sigma-Aldrich, Praha, tsjekkia) ble brukt som løsemidler. Plantematerialet som ble brukt til eo-destillasjonen ble kjøpt fra kommersielle kilder (F-DENTAL, Hodoní, tsjekkia). EO ble ekstrahert ved hydrodistillering ved Bruk Av Clevenger-type apparat.

2.2. Kjemisk Analyse AV EO Ved Gasskromatografi-Massespektrometri (GC-MS)

e. rostkoviana EO ble analysert AV GC-MS ved Hjelp Av Agilent 7890a GC koblet Til Agilent 5975C enkelt-quadrupole massedetektor utstyrt med EN HP-5ms kolonne (30 m × 0.25 mm, 0.25 µ film) Fra Agilent (Santa Clara, CA, USA). Heksan ble brukt som løsemiddel og prøvevolumet på 1 µ ble injisert i delt modus (forhold 20 : 1) i injektoren oppvarmet til 250°C. startovnstemperaturen ble satt til 60°C i 3 min, programmert til 230°C med en hastighet på 3°C/Min, og deretter holdt konstant i 10 Min. Helium ble brukt som bæregass med en strømningshastighet på 1 mL / min. MS-analysen ble utført i fullskannemodus og elektronioniseringsenergien ble satt til 70 eV. Identifikasjonen av individuelle komponenter var basert på sammenligning av deres massespektra og relative retensjonsindekser med National Institute Of Standards and Technology Library (NIST, USA) og litteratur , samt coinjection of authentic standard.

2.3. Bakteriestammer og Dyrkningsmedier

standardstammene til tre Gram-positive bakterier Enterococcus faecalis Atcc 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213 og S. epidermidis ATCC 12228, Tre Gram-negative bakterier Escherichia coli atcc 25922, Klebsiella pneumoniae atcc 700603, Og Pseudomonas aeruginosa atcc 27853, og en gjær Candida albicans ATCC 10231 ble oppnådd Fra Oxoid (Basingstoke, Storbritannia). Kationjustert Mueller-Hinton buljong (MHB) og Sabouraud dekstrosebuljong (SDB) ble brukt som dyrkingsmedier for henholdsvis antibakteriell og antifungal mikrodilusjonsanalyse, og ble likevekt med Tris-bufret saltvann (Sigma-Aldrich, Praha, tsjekkia). Mueller-Hinton agar (MHA) og Sabouraud dextrose agar (SDA) ble brukt til etterfølgende bestemmelse av henholdsvis bakteriedrepende og fungicide konsentrasjoner. Alle medier ble kjøpt fra Oxoid (Basingstoke, Storbritannia).

2.4. Minimum Inhibitorisk Konsentrasjon (MIC) Bestemmelse

Mic-ene ble bestemt ved hjelp av in vitro-kjøttmikrodilusjonsmetoden etter retningslinjene Fra Clinical And Laboratory Standards Institute (CLSI) modifisert i henhold til anbefalingene foreslått for effektiv vurdering av antiinfeksjonspotensialet av naturlige produkter ved bruk av 96-brønnmikrotiterplater. Kort sagt ble EO oppløst I DMSO med Tilsetning Av Tween 80 og to ganger serielle fortynninger ble fremstilt I MHB for bakterier og I SDB for gjær, mens konsentrasjonene som ble testet varierte fra 4 til 2048 µ/mL. Inokulumet ble tilberedt fra kulturer over natten, slik at DE første CFU-konsentrasjonene i mikroplatene var henholdsvis 5 × 105 og 2 × 103 CFU/mL for bakterier og gjær. De inokulerte platene ble undersøkt etter 24 timer med inkubasjon ved 35°C og en gang til etter 48 timer ved C. albicans. Den mikrobielle veksten ble målt spektrofotometrisk Av Multiscan Ascent Microplate Photometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) ved 405 nm. MICs ble uttrykt som de laveste konsentrasjonene som kunne hemme ≥ 80% av bakterievekst sammenlignet med positiv vekstkontroll. Forsøkene ble utført i tre eksemplarer i tre uavhengige tester og medianverdier ble brukt Til MICs-beregning. På grunn av den nylig rapporterte muligheten FOR eo flyktige komponenters innflytelse på den mikrobielle veksten i tilstøtende brønner , ble positive vekstkontrollrader satt inn mellom eo fortynningsrader for å oppdage eventuell vekstpåvirkning. De anvendte løsningsmidlene hemmet ikke bakterieveksten ved testede konsentrasjoner. Ciprofloxacin og tiokonazol ble brukt som referanse antibiotika for henholdsvis bakterier og gjær.

2.5. Minimum Bakteriedrepende Konsentrasjon (MBC) og Minimum Fungicid Konsentrasjon(Mfc) Bestemmelse

alikvotene på 20 µ ble overført fra hver brønn uten mikrobiell vekst til MHA-platene (SDA-plater For c. albicans)etter henholdsvis 24 timer og 48 timer inkubasjon av bakterier og gjær testet. Platene ble deretter inkubert i 24 timer ved 35°C. MBC og MFC ble evaluert som ≥99,9% reduksjon I CFU sammenlignet med inokulum, alle utført i tre eksemplarer i tre uavhengige tester.

3. Resultater og Diskusjon

3.1. Kjemisk Karakterisering Av Oljer og Bioaktive Fraksjoner Bestanddeler

Eo hydrodistillation Av Clevenger-type apparat ga 0,02% (w/v) av gulbrun olje som har en tendens til å størkne ved romtemperatur som sannsynligvis er forårsaket av høy andel av fettsyrer (32,23% totalt). Gc-MS analyse av EO viste tilstedeværelsen av mer enn 70 bestanddeler, med palmitinsyre (18,47%) som den mest omfattende komponenten etterfulgt av tymol (7,97%), myristinsyre (4,71%), linalool (4,65%), anetol (4,09%), linolensyre (3,81%), hexahydrofarnesyl aceton (3,16%), laurinsyre (2.79%), α-terpineol (2.39%), and borneol (2.39%). The main compounds are shown also in the chromatogram (Figure 1) and the complete list of EO constituents is presented in Table 1.

det høye innholdet av fettsyrer har tidligere blitt funnet I e. stricta EO (25,7% totalt) også med den høyeste andelen palmitinsyre (20,3%) og myristinsyre (3,9%) . Imidlertid er det ingen annen forbindelse tilstede i betydelig mengde som vil indikere slektskapet til disse To Euphrasia-artene.

3.2. Antimikrobiell Aktivitet

E. rostkoviana eo viste aktivitet mot seks av syv organismer testet med Mikrofoner som varierte fra 512 til 2048 µ / mL. De Gram-positive bakteriene var mer følsomme enn De Gram-negative og gjæren mens P. aeruginosa var Den eneste organismen som Ikke ble hemmet av oljen ved de høyeste konsentrasjonene som ble testet. MICs, MBCs og MFCs AV EO mot alle mikroorganismer testet er oppsummert I Tabell 2. De aktive konsentrasjonene er sammenlignbare med de som tidligere er rapportert for For Eksempel Eos Av Artemisia annua, Eucalyptus globulus, Mentha suaveolens, Myrtus communis, Ocimum basilicum eller Thymus vulgaris, spesielt ved anticandidal aktivitet . Oljen var også mer effektiv enn e. rostkoviana ekstrakter testet Av Teixeira Og Silva mot E. coli, e. faecalis, s. aureus og s. epidermidis. MICs av referanse antibiotika mot bakterier og gjær utsatt For E. rostkoviana EO var i samsvar med CLSI akseptable grenser og tidligere rapporter, henholdsvis .

siden innholdet av den VIKTIGSTE eo-bestanddelen palmitinsyre ikke overstiger 20%, og det er mer enn 10 andre antimikrobielle aktive forbindelser fra 1 til 8%, er det vanskelig å foreslå de viktigste midlene som er ansvarlige for e. rostkoviana EO antimikrobiell effekt. Palmitinsyre har tidligere blitt identifisert som hovedforbindelsen av fraksjoner som er aktive mot Gram-negative, men Ikke Gram-positive bakterier . På den annen side er mellomstore mettede fettsyrer og langkjedede umettede fettsyrer kjent for å hemme spesielt Gram-positive bakterier . Videre utøver laurinsyre også aktivitet mot en rekke sopp . Således skyldes den antimikrobielle aktiviteten til EO sannsynligvis en kompleks virkning av de antimikrobielle fettsyrene med de andre kjente antimikrobielle forbindelsene som er identifisert I EO, som anethol, borneol, kamfer, carvacrol, linalool, mentol, α-terpineol eller tymol.

4. Konklusjoner

til slutt viste kjemisk analyse en rekke antimikrobielle aktive stoffer tilstede I E. rostkoviana EO og dets antifungal og antibakterielle aktivitet mot Gram-positive så Vel Som Gram-negative bakterier ble bekreftet. Så vidt vi vet er dette den første rapporten om Sammensetningen Og antimikrobiell aktivitet Av e. rostkoviana EO.

Interessekonflikt

forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikt angående publisering av dette papiret.

Takk

dette arbeidet ble økonomisk støttet Av European Science Foundation og Departementet For Utdanning, Ungdom Og Idrett i tsjekkia Prosjektet CZ.1.07/2.3.00/30.0040; av s-stipend Fra Departementet For Utdanning, Ungdom Og Idrett i tsjekkia; og ved den tsjekkiske Universitetet For Miljø-Og Biovitenskap Praha Prosjekt iga 20155012. Forfatterne er takknemlige For Slavka Barlakova for engelsk korrekturlesing.