hva er forskjellen mellom En Sørlig, Nordlig Og Vestlig Blot?

Ulike blotting teknikker brukes til å identifisere unike proteiner og nukleinsyresekvenser. Sørlige, nordlige og vestlige blot-protokoller er like, og begynner med elektroforetisk separasjon av protein-og nukleinsyrefragmenter på en gel, som deretter overføres til en membran (nitrocellulosemembran, polyvinylidendifluorid (PVDF) membran, etc.) hvor de er immobilisert . Dette gjør det mulig for radiomerkede eller enzymatisk merkede antistoff-ELLER DNA-prober å binde det immobiliserte målet, og molekylene av interesse kan da visualiseres med forskjellige metoder. Blotting teknikker velges basert på målmolekylet: DNA, RNA eller protein. (Figur 1, Tabell 1).

Southern Blot

Southern blot Brukes til å bestemme identitet, størrelse og overflod av spesifikke DNA-sekvenser. Southern blot-protokollen begynner MED DNA-ekstraksjon fra celler eller vev, som deretter enzymatisk fordøyes for å produsere DNA-fragmenter. Fragmentene separeres etter størrelse på en agarose eller polyakrylamidgel via elektroforese. Mindre fragmenter vil migrere lenger på gelen enn større. Etter elektroforese overføres DNA på gelen til en nylonmembran. Membranen inkuberes med en nukleinsyresonde som har en sekvens som er homolog til målsekvensen og er merket med radioaktivitet, fluorescerende fargestoff eller et enzym som er i stand til å generere et kjemiluminescerende signal. Hybridisering av komplementære sekvenser skjer under inkubering, og den uhybridiserte sonden fjernes ved vask med buffer. De fullt hybridiserte merkede sondemolekylene vil forbli bundet til blottet. Deteksjonsmetoder varierer basert på sondeetiketten; radiomerkede prober visualiseres Med Røntgenfilm eller fosforimaging, og enzymatisk merkede prober visualiseres med kjemiluminescerende substrat.

Southern blot protocol

1. DNA isolasjon
2. Begrensning fordøyelse: fordøye DNA med en begrensning enzym, og om nødvendig, konsentrere fordøyd DNA.
3. gelelektroforese: klargjør en agarosegel og ENTEN TAE-eller TBE-buffer (buffervalg vil avhenge av løpets varighet og STØRRELSEN PÅ DNA-fragmentene). Last prøver i brønner og inkludere EN DNA molekylvekt markør. Kjør gelen.
4. Transfer:
   • Plasser gelen i en beholder med denatureringsløsning, og vask to ganger i 15 minutter på en rister.
   • Skyll med vann, vask deretter med nøytraliseringsløsning.
   • i løpet av forrige trinn begynner Du å forberede Whatman-papir og nylonmembran for overføringen.
   • Monter overføringsapparatet med membranen, Whatman-papiret og gelen og overfør I SSC-eller SSPE-buffer.
   • når overføringen er fullført, kryss-link DNA I en kryss-linker, skyll deretter membranen.
5. pre-hybridisering (blokkering):
   • Blokkering reduserer ikke-spesifikk binding til membranen. Forbered pre-hybridiseringsløsningen og legg til prøve-DNA. Fjern blottet fra krysslinkeren, legg til pre-hybridiseringsløsningen og inkuber.
6. Hybridisering:
   • Forbered sondeblandingen (en komplementær DNA-streng) og buffer.
   • Fjern pre-hybridiseringsløsningen og inkuber blottet med sonden (inkubasjonstiden vil variere avhengig av applikasjonen).
   • etter inkubasjon, utfør en lavstrengende vask etterfulgt av en høystrengende vask for å avgrense DNA.
7. Sonde deteksjon:
   • Skyll membranen, overfør til en beholder med blokkerende løsning og inkuber.
   • Kast blokkeringsløsning, erstatt med antistoffoppløsning og inkuber.
   • Kast antistoffoppløsning, vask membranen.
8. Følg produsentens anvisninger for kjemiluminescerende deteksjon.

Northern Blot

Northern blots brukes til å bestemme identitet, størrelse og overflod av spesifikke RNA-sekvenser. Northern blot protokoller begynner MED rna-isolasjon, og separasjonsteknikker varierer avhengig AV rna-størrelse. Store Rna separeres ved elektroforese på en formaldehyd agarose gel eller glyoxal agarose gel, som forhindrer normal baseparering og opprettholder RNA i denaturert tilstand. Små Rna separeres på en denaturerende (urea) polyakrylamidgel. RNA overføres deretter fra gelen til en nylonmembran som deretter inkuberes med en radioaktivt eller nonisotopisk merket RNA, DNA eller oligodeoksynukleotidprobe. Den uhybridiserte sonden fjernes ved vask med buffer. Radiomerkede prober visualiseres Med Røntgenfilm, og enzymatisk merkede prober visualiseres med kjemiluminescens.

Northern blot protocol

1. Rna isolasjon
2. Elektroforese:
   • for en formaldehyd agarose gel: klargjør gelen og sett gelbrettet inn i apparatet. Fyll MED MOPS buffer, laste prøvene og inkluderer en molekylvekt markør. Kjør gel, deretter trimme gel før blotting.
   • for en glyoksal agarosegel: klargjør gelen og sett gelbrettet inn i apparatet. Fyll MED MOPS buffer, forberede prøver og laste inn brønner sammen MED RNA stige.
   • for en denaturerende polyakrylamidgel: kast gelen og monter den i elektroforese-enheten. Forbered prøver, legg inn i gelen, og kjør MED TBE running buffer.
3. Overføring:
   • for en formaldehyd agarose gel eller glyoxal agarose gel: vask gelen I SSC, og monter deretter overføringsenheten med gel, filterpapir og nylonmembran. Når overføringen er fullført, plasser membranen I EN UV-krysslinker.
   • for en denaturerende polyakrylamidgel: monter overføringsenheten, inkludert gel, filterpapir og nylonmembran, slik at DE oversvømmes MED TBE. Når overføringen er fullført, plasser membranen I EN UV-krysslinker for å fikse RNA til membranen.
4. Pre-hybridisering (blokkering):
   • pre-hybridisere membranen i hybridisering løsning.
5. Hybridisering:
   • Legg sonde til hybridiseringsløsningen og inkuber.
   • Vask membranen i lavstrengingsvask for å fjerne hybridiseringsløsning og uhybridisert sonde, og høystrengingsvask for å fjerne delvis hybridiserte molekyler.
   • Følg produsentens anvisninger for kjemiluminescerende deteksjon.

Western Blot

Western blots brukes til å bestemme identitet, størrelse og overflod av spesifikke proteiner i en prøve. Western blot-protokollen begynner med prøvelysatpreparasjon fra vev eller cellekultur og separasjon på en polyakrylamidgel via elektroforese. De separerte proteinene overføres deretter til en nitrocellulose-eller polyvinylidendifluorid (PVDF) membran. Membranen inkuberes med et blokkerende middel for å forhindre uspesifikk binding, etterfulgt av inkubasjon med et primært antistoff for å binde proteinet av interesse. Det finnes to metoder, direkte og indirekte. Direkte deteksjon (Figur 2) er avhengig av et merket primært antistoff, mens indirekte deteksjon krever et primært antistoff rettet mot målproteinet, og et sekundært antistoff rettet mot immunoglobinklassen eller underklassen av det primære antistoffets art(Figur 3). Visualiseringsmetoder inkluderer kolorimetriske analyser der et farget bunnfall produseres, kjemiluminescens og fluorescens.

Western blot protocol

1. Forbered lysat fra cellekultur eller vev.
2. Prøvepreparering:
   • Bestem proteinkonsentrasjonen av hver prøve med en proteinkvantifiseringsanalyse (dvs. Bradford assay).
   • Legg til et likt volum På 2x laemmli prøvebuffer til hver prøve.
   • Noen prøver må kanskje reduseres eller denatureres, dette oppnås ved å koke prøver i buffer.
3. Elektroforese:
   • Forbered EN sds-SIDE gel, last prøver sammen med molekylvektmarkør.
   • Kjør gelen i løpende buffer.
4. Overføring:
   • etter elektroforese, montere overføringsenheten inkludert gel, PVDF eller nitrocellulose membran, og filterpapir.
   • Overfør proteinene til membranen med overføringsbuffer.Antistofffarging (indirekte deteksjon): Forbered blokkeringsbuffer og inkuber membranen for å redusere ikke-spesifikk binding.
   • Inkuber membranen med primært antistoff fortynnet i blokkeringsbuffer.
   • Vask membranen i TBST, og inkuber med konjugert sekundært antistoff fortynnet i blokkeringsbuffer.
   • Vask membranen I TBST.
   • Følg produsentens anvisninger for kjemiluminescerende deteksjon.