4.2.1 Polymerase II

selv om transkripsjonsterminering har blitt mye mindre utforsket enn initieringen, har de siste 25 årene avslørt at den godt timet og nøyaktige utgivelsen av det naserende transkripsjonen og rna-polymerasene fra DNA-malen er avgjørende for skjebnen TIL RNA, så vel som for det totale genomvedlikeholdet.To mekanismer har blitt foreslått for denne prosessen i tilfelle av mRNA-kodende gener, allosterisk (antiterminator) og torpedo (Fig. 7.2 A; vurdert I Refs. ). Den allosteriske modellen postulerer at 3 ‘ prosesseringsfaktorer utløser konformasjonsendringer i transkripsjonsforlengelseskomplekset, noe som letter dissosiasjonen av antiterminatorfaktorer og/eller binding av terminasjonsfaktorer . Torpedomodellen ble først foreslått Av Connelly Og Manley Og Proudfoot, som foreslo at 3 ‘pre-mRNA-produktet generert av spaltnings – og polyadenyleringsapparatet blir angrepet av 5’ -3 ‘ exoribonukleaseaktivitet, som nedbryter Pol II-assosiert RNA raskere enn det er syntetisert, mens polymerasen fjernes fra malen. Faktisk er begge termineringsbanene ofte orkestrert og, med noen unntak, kan forenes i en allosterisk-torpedo-modell .

figur 7.2. Funksjon Av Rat1 i torpedomekanismen for transkripsjonsterminering. (A) den gryende Pol II mRNA transkripsjon spaltes cotranscriptionally Av Ysh1 komponent av spalting og polyadenylering spesifisitet faktor (cpsf). Den resulterende eksponerte monofosforylerte 5 ‘ – enden av nedstrøms RNA er et substrat for rask nedbrytning Av Rat1 / Rai1, som hadde blitt rekruttert til pol II-komplekset via Pcf11 og Rtt103-proteiner som interagerer Med Ser2-fosforylert CTD. Forlengelseskomplekset destabiliseres når Rat1 / Rai1 fanger opp polymerasen. Rat1-avhengig avslutning stimuleres Av Sen1-helikasen som interagerer Med rpb1 large Pol II-underenheten og letter Rat1-rekruttering. (B) den nylig syntetiserte pre-rRNA spaltes cotranscriptionally Av rnt1 endonuklease og den resulterende 3 ‘ produktet er degradert Av Rat1 / Rai1, som torpederer Pol I. effektiv pol i terminering krever også binding Av Nsi1 og / Eller Reb1 På T1 terminator (grønn boks), forårsaker polymerase pause, Pol i-spesifikke underenhet Rpa12 og helicase Sen1, som assosierer med rDNA og direkte samhandler med Rnt1. (Se fargeplate-delen på baksiden av boken.) Den effektive pol i terminering krever også binding Av Nsi1 Og / Eller Reb1 På T1 terminator (grønn boks), forårsaker polymerase pause, Pol i-spesifikke underenhet Rpa12 og helicase Sen1, som assosierer med rDNA og direkte samhandler med Rnt1.

senere arbeid viste At Rat1 i gjær og Xrn2 hos mennesker var ansvarlig for torpedo aktivitet og at mangel på enten enzym, Samt Rat1 aktivator Rai1 i gjær, fører til en oppsigelse defekt, som manifesterer seg som en omfattende transkripsjon lese gjennom. Det er også mulig at en Plante Rat1 homolog, Arabidopsis AtXRN3, fungerer som en transkripsjon termineringsfaktor på samme Måte Som Rat1 / Xrn2. High-throughput tilnærminger avdekket en akkumulering av ikke-kodende transkripsjoner fra 3 ‘ – enden av mRNA og microRNA (miRNA) gener i xrn3 knockdown mutant, som kan tilsvare transkripsjonelle lese gjennom molekyler . Dermed, AtXRN3 kan delta i en global rna 3’-end overvåking som et resultat av sin torpedo terminering aktivitet.

torpedomekanismen avhenger Av Eksonukleasekatalytisk aktivitet Av Rat1, og ikke bare på dens tilstedeværelse . Det monofosforylerte rna-substratet For Rat1 / Xrn2 under mRNA-syntese genereres som et resultat av en cotranscriptional spaltning (CoTC) på polyadenyleringsstedet av mRNA 3 ‘ – end-formasjonsmaskineriet. Nærmere bestemt utføres Denne prosessen Av Ysh1-komponenten AV CF II i gjær eller den tilsvarende CPSF-73-underenheten av den menneskelige spaltning og polyadenyleringsspesifikasjonsfaktor (CPSF) (vurdert I Ref. ). To faktorer ble foreslått for å bidra til effektiv oppsigelse: styrken til poly (A) – signalet og virkningen av eksonuklease som nedbryter 5 ‘ – spaltningsproduktet, noe som letter pause av polymerasen nedstrøms for poly (A) – stedet og fremmer frigjøringen . Pa den annen side avskaffer svekket Rat1-avhengig oppsigelse ikke riktig poly (A)-site anerkjennelse og mRNA-spaltning .

Ytterligere Rat1 / Xrn2 – innføringssteder kan oppstå ved autokatalytisk CoTC nedstrøms for poly (A) – området i pattedyr eller endonukleolytisk spalting Av Rnt1 i gjær . Sistnevnte tilfelle ble rapportert som en feilsikker termineringsmekanisme for proteinkodende gener, som sammen med banen mediert Av Nrd1/Nab3/Sen1-komplekset (NRD), gir en backupmodus for pol II-frigjøring.

Selv Om Rat1 / Xrn2 er nødvendig for effektiv pol II-terminering, mislykkes Rat1 i å utløse terminering in vitro, og dens 5′ -3 ‘ degraderingsaktivitet er ikke tilstrekkelig til å fremme polymerasedissosiasjon in vivo. Konsekvent, gjær Xrn1 rettet mot kjernen er i stand til cotranscriptional degradering AV gryende RNA, men ikke redde oppsigelse defekter forårsaket Av En Rat1 mangel. Disse observasjonene tyder på at eksonuklease fange opp med polymerase er nødvendig, men ikke tilstrekkelig til å destabilisere forlengelse kompleks, og at et ekstra element av torpedo mekanismen opererer under avslutning. Det har blitt postulert At En Rat1 unik funksjon, det utvidede tårndomenet, som ikke finnes I Xrn1-proteiner, kan være ansvarlig for termineringsegenskapene . Det er tenkelig at tårndomenet gjennomgår visse modifikasjoner eller fungerer som et grensesnitt for samspill med termineringsforbedrende faktorer. En av de mulige kandidatene for faktorer som stimulerer Rat1-avhengig terminering er rna-helikasen Sen1, som er en nøkkelkomponent i termineringsveien for ikke-kodende Rna i gjær (se nedenfor) som også bidrar til terminering av proteinkodende gener, med den sterkeste effekten på kortere mrna . Sen1 interagerer via Sitt N-terminale domene med den største Pol II-underenheten, Rpb1 og forringende Sen1-helikaseaktivitet forringer Genom-bred pol II-distribusjon over kodende og ikke-kodende gener . Den humane sen1-homologen, Senataxin, ble vist å direkte fremme Xrn2-mediert transkripsjonsterminering ved å løse RNA: DNA-hybrider (R-looper) dannet bak den forlengende Pol II, hovedsakelig Ved G-rike pausesteder nedstrøms for poly(A) – stedet . Denne aktiviteten letter Tilgangen Til Xrn2 til poly (A) site 3 ‘ spaltningsprodukter og bidrar dermed til rekruttering av torpedoeksonuklease. Virkemåten til gjær Sen1 antas å være lik .et ubesvart spørsmål er Hvordan Rat1 rekrutteres til den forlengende polymerasen. Flere observasjoner støtter Rat1-tilknytning via proteiner som interagerer Med Pol II C-terminal-domenet (CTD) gjennom DERES CTD-interagerende domene (CID), nemlig Pcf11-underenheten av gjærspaltningsfaktoren IA (CFIA) og Rtt103 (regulator For Ty1 transposisjon 103). Rat1 Og Rai1 er til stede på arrangører og koding regioner med en sterk anrikning på 3 ‘ – ender av gener. Den funksjonelle samspillet Mellom Rat1 Og Pcf11 ble vist å lette den gjensidige corecruitment av begge faktorer: Rat1 kobler oppsigelse til 3 ‘- end dannelse ved å stimulere rekruttering av 3 ‘ – end prosesseringsfaktorer, spesielt CFIA underenheter Pcf11 Og Rna15, Mens Pcf11 bidrar Til Rat1 foreningen over poly (A) området . Også human Pcf11 ble vist å forbedre nedbrytning AV nascent RNA og fremme transkripsjonsterminering . I sin tur, Rtt103, som også assosierer nær 3’-endene av gener, copurifies Med Rat1, Rai1, Og Pcf11, og sammen Med Pcf11 gjenkjenner samvirke SER2-fosforylert CTD av elongating Pol II . På Den annen side er Rat1-fordeling over gener ikke endret i fravær Av Rtt103 . I Tillegg, Rat1 avslutter også transkripsjon Av Pol I, som mangler EN CTD, noe som tyder På At Rat1 rekruttering kan også skje via andre mekanismer. Faktisk ble foreningen av hXrn2 rapportert å være mediert av p54nrb / pfs (protein-associated spleising factor), som er multifunksjonelle proteiner involvert i transkripsjon, spleising og polyadenylering . Rollen til p54nrb / PFS i pol II transkripsjonsterminering ble også demonstrert I C. elegans.I tillegg til mrna syntetiserer Pol II et bredt spekter av ikke-kodende transkripsjoner, inkludert små nukleære Rna og snorna og en rekke ustabile Rna. I gjær avsluttes transkripsjonen av disse relativt korte artene hovedsakelig av et alternativt NRD-kompleks, sammensatt av RNA-bindende proteiner Nrd1 Og Nab3 og DEN ATP-avhengige helikasen Sen1 . Siden denne mekanismen mest sannsynlig ikke innebærer en cotranscriptional endonukleolytisk spaltning, er Det Sen1 RNA:DNA hybrid-avvikende aktivitet som antas å være avgjørende for polymerasedissosiasjon, kanskje på en måte som ligner på bakteriell Rho DNA–rna helikase. Rho destabiliserer sannsynligvis forlengelseskomplekset ved å translokere langs og fjerne det naserende RNA fra polymerasen . En alternativ, allosterisk modell forutsetter At Rho laster på polymerase og induserer omarrangementer i enzymets aktive sted på termineringssteder . Begge virkemåter kan godt gjelde For Sen1 helicase.

Selv Om Rat1 rekrutteres til snoRNA-gener, spesielt introniske, er NRD-avhengig avslutning av snoRNA-transkripsjoner ikke svekket når det mangler, og det ble derfor foreslått at Det deltar i noen premature termineringshendelser . Det er fortsatt mulig, derimot, At Rat1 torpedo mekanisme kan bidra til transkripsjon avslutning av snoRNAs, slik Som U3 eller snR40, hvis 3 ‘- end er utgitt Av Rnt1 cleavage som eksponerer den gjenværende gryende transkripsjon 5 ‘ – end For Rat1 angrep .Overraskende Nok ble Rat1 vist å kolokalisere Med Pcf11 ved telomerer og Ved pol III-transkriberte trna -, 5S rRNA-og SCR1-gener . Den funksjonelle betydningen av disse observasjonene er foreløpig uklar, men alternative termineringsmoduser for Disse Rna, og nedbrytning av avvikende transkripsjoner eller behandling av ustabile ikke-kodende Rna , som telomere TERRA, er en mulighet (Tabell 7.1).