shRNA versus siRNA

RNA interferentie (RNAi) is een biologisch proces waarbij RNA-moleculen worden gebruikt om genexpressie te remmen. Typisch, worden de korte molecules van RNA gecreeerd die aan endogeen mRNA complementair zijn en wanneer geà ntroduceerd in cellen, aan doel mRNA binden. De band van de korte molecule van RNA aan doel mRNA inactiveert functioneel doel mRNA en leidt soms tot degradatie van doel mRNA.

historisch gezien zijn twee soorten korte RNA-moleculen gebruikt in RNAi-toepassingen. Klein interfererend RNA (siRNA) zijn typisch dubbelstrengs RNA molecules, 20-25 nucleotiden in lengte. Wanneer getransfecteerd in cellen, remt siRNA het doel mRNA tijdelijk tot zij ook binnen de cel worden gedegradeerd. De kleine haarspeldrnas (shRNA) zijn opeenvolgingen van RNA, typisch ongeveer 80 basisparen in lengte, die een gebied van interne kruising omvatten die tot een haarspeldstructuur leidt. de molecules van shRNA worden verwerkt binnen de cel om siRNA te vormen die beurtelings genuitdrukking neerhalen. Het voordeel van shRNA is dat zij in plasmidevectoren kunnen worden opgenomen en in genomic DNA voor langere termijn of stabiele uitdrukking, en zo langere neerhalen van doel mRNA kunnen worden geïntegreerd.

effectieve expressie van shRNA ’s uit RNA-Polymerase III-promotors

kleine RNA’ s waaronder shRNA ‘ s worden endogeen getranscribeerd met RNA-Polymerase III (Pol III). Dit is verschillend van cDNAs die gebruikend polymerase II van RNA worden getranscribeerd. daarom, om hoge uitdrukking van shRNAs te waarborgen, gebruikt Cellecta promotors die specifiek Pol III, U6 en H1 promotors binden. Zowel de U6 als H1 promotors werken goed om hoge niveaus van shRNAacross vele celtypes uit te drukken, in vergelijking met Pol II promotors zoals CMV en EF1, die shRNAs niet zo effectief uitdrukken vanwege hun kleine grootte. Bovendien kunnen de promotors van Pol II die voor het uitdrukken van shMIRs worden gebruikt niet in de meeste celtypes werken, waar U6 en H1 goed werken.

lentivirale vectoren maken Permanent neerhalen van doelwitten mogelijk

de shRNA wordt stabiel geïntegreerd in het genoom van de gastheercel. Als cellen delen, wordt shRNA doorgegeven aan dochtercellen. Het gebruiken van lentiviral vectoren voor uitdrukking van shRNAs verstrekt permanente neerhalen zonder de cellen veelvoudig te moeten transfecteren. Om meer te weten te komen over hoe lentiviral vectoren werken, verwijs naar onze lentiviral Vector systeem pagina.

optimalisatie van het shRNA-ontwerp

het ontwerpen van effectieve shRNA ‘ s is essentieel voor een effectieve afkickcontrole van RNAi. Naast het kiezen van de optimale opeenvolging, zijn er een aantal structurele factoren die de doeltreffendheid van shRNA beà nvloeden. Bovendien stelt de stam-lus haarspeldstructuur van shRNA problemen voor bibliotheekbouw en versterking. Om representatieve kwaliteit shRNA-bibliotheken te creëren, hebben we aanzienlijke inspanningen geleverd om de effectiviteit van de shRNA-inserts in onze bibliotheken te optimaliseren. We hebben een intern algoritme ontwikkeld om de meest effectieve shRNA-sequenties te voorspellen en dit te combineren met gepubliceerde gegevens van gevalideerde sequenties bij het samenstellen van onze bibliotheken. We hebben ook geoptimaliseerd de structuur van shRNA voor bibliotheek Bouw.

om variaties in de shRNA-structuur op grote schaal efficiënt te testen, ontwikkelden we een shRNA-effectiviteitstesttechnologie met hoge doorvoer op basis van een reporter-assay. Men toonde eerder aan dat een verslaggeversgen (zoals GFP) met een 3′ fusie aan een cDNA-fragment of kort oligonucleotide van een doelgen effectief zou kunnen worden gebruikt om de doeltreffendheid van siRNA te controleren en shRNA construeert tegen dit doelgen. Op basis van deze bevindingen ontwikkelden we een lentivirale reporter vector voor identificatie van functionele shRNA constructies (figuur 1). Onze eigen shRNA testende reporter vector staat voor het klonen van zowel shRNA-malplaatje stroomafwaarts van de promotor H1 en doelopeenvolgingen aan het 3′ eind van de GFP-reporter toe. Wanneer dit construct in cellen wordt omgezet, produceert de transcriptie van de H1-promotor shRNA, terwijl de transcriptie van de CMV-promotor een mRNA-fusietranscript van het GFP-betekenisdoel genereert dat als verslaggever voor het onderzoeken van functionele shRNAs kan worden gebruikt.

kaart van shRNA-target lentiviral reporter construct geïntegreerd in genomisch DNA en mechanisme van knockdown van GFP-target reporter. De cellen die met functionele shRNA-constructies worden getransducteerd zullen lage GFP mRNA-niveaus hebben, terwijl niet-functionele shRNAs een hoog niveau van GFP mRNA-uitdrukking toestaan.om de structuur van de shRNA te optimaliseren, bouwden we een shRNA-target bibliotheek in de shRNA validatievector voor 150 shRNA ‘ s, waarbij elke shRNA werd geconstrueerd in 40 verschillende ontwerpen die in de literatuur worden beschreven.

we voerden RNAi-schermen uit in CHO-TRex-cellen die werden getransduceerd met deze shRNA-Doelbibliotheek met 150×40 barcodes en gemeten representatie (in de bibliotheek en transduced cellen) en neerslagefficiëntie van elke shRNA-constructie. Hieronder worden enkele representatieve gegevens van deze screening weergegeven.

de tien beste ontwerpen werden geselecteerd op basis van de ontwerpen met de hoogste doelwerende activiteit, gelijke amplificatie-efficiëntie van gepoolde oligonucleotiden met hetzelfde ontwerp en gelijke representatie van hetzelfde ontwerp shrnas in de gepoolde RNAi-bibliotheken. De neerhalingsefficiëntie van drie p53 shRNAs die met deze 10 beste ontwerpen in een lentiviral Vector wordt geconstrueerd werd verder geanalyseerd door RT-PCR na transductie in muizenfibroblastcellen.