Wat is het verschil tussen een zuidelijke, noordelijke en Westelijke vlek?

verschillende blottechnieken worden gebruikt om unieke eiwitten en nucleïnezuursequenties te identificeren. De Zuidelijke, noordelijke, en westelijke vlekprotocollen zijn gelijkaardig, en beginnen met elektroforetische scheiding van proteã ne en nucleic zure fragmenten op een gel, die dan naar een membraan (nitrocellulose membraan, polyvinylidene difluoride (PVDF) membraan, enz.worden overgebracht.) waar ze geïmmobiliseerd zijn. Dit laat radiolabeled of enzymatisch geëtiketteerd antilichaam of de sondes van DNA toe om het geà mmobiliseerde doel te binden, en de molecules van belang kunnen dan met diverse methodes worden gevisualiseerd. De bevlektingstechnieken worden geselecteerd gebaseerd op de doelmolecule: DNA, RNA, of proteã ne. (Figuur 1, Tabel 1).

Zuidelijke vlek

Zuidelijke vlekken worden gebruikt om de identiteit, grootte en abundantie van specifieke DNA-sequenties te bepalen. Het zuidelijke vlekprotocol begint met de extractie van DNA uit de cellen of weefsels, die dan enzymatisch wordt verteerd om fragmenten van DNA te produceren. De fragmenten worden gescheiden door grootte op een agarose of polyacrylamidegel via elektroforese. Kleinere fragmenten zullen verder op het gel migreren dan Grotere. Na elektroforese, wordt DNA op het gel overgebracht naar een nylon membraan. Het membraan wordt geïncubeerd met een nucleic zure sonde die een opeenvolging homologe aan de doelopeenvolging heeft en met radioactiviteit, fluorescente kleurstof, of een enzym kan een chemiluminescent signaal produceren geëtiketteerd. De kruising van aanvullende opeenvolgingen komt tijdens incubatie voor, en de ongehybridizeerde sonde wordt verwijderd door met buffer te wassen. De volledig gekruiste geëtiketteerde sondemolecules zullen aan de vlek gebonden blijven. Detectiemethoden verschillen op basis van het sonde-label; radiolabeled sondes worden gevisualiseerd met röntgenfilm of phosphorimaging, en enzymatisch geëtiketteerde sondes worden gevisualiseerd met chemiluminescent substraat.

Southern blot protocol

1. DNA-isolatie
2. restrictie spijsvertering: verteer het DNA met een restrictie-enzym, en indien nodig, concentreer het verteerde DNA.
3. gelelektroforese: bereid een agarose gel en ofwel TAE of TBE buffer (buffer selectie zal afhangen van de duur van de run en de grootte van de DNA-fragmenten). Ladingssteekproeven in Putten en omvatten een teller van het molecuulgewicht van DNA. Draai de gel.
4. Transfer:
   • plaats de gel in een recipiënt met denatureringsoplossing en was tweemaal gedurende 15 minuten op een schudapparaat.
   • spoelen met water, daarna wassen met neutralisatieoplossing.
   • begin tijdens de vorige stap Whatman-papier en nylon membraan voor te bereiden op de overdracht.Monteer het transferapparaat met het membraan, Whatman-papier en gel en breng het over in SSC-of SSPE-buffer.
   • wanneer de overdracht is voltooid, cross-link DNA in een cross-link, spoel het membraan.
5. Pre-hybridisatie (blokkering):
   • blokkering vermindert niet-specifieke binding aan het membraan. Bereid de pre-hybridisatieoplossing voor en voeg monsterdna toe. Verwijder de vlek van de cross-linker, voeg de pre-hybridisatieoplossing toe en incubeer.
6. hybridisatie:
   • bereid het probe-mengsel (een complementaire DNA-streng) en de buffer voor.
   • verwijder de pre-hybridisatieoplossing en incubeer de vlek met de sonde (incubatietijd zal variëren afhankelijk van de toepassing).
   • na incubatie een was met een lage stringency, gevolgd door een was met een hoge stringency om het DNA te verfijnen.
7. Sondedetectie:
   • spoel het membraan, breng over in een container met blokkeeroplossing en incubeer.
   • Verwijder blokkeringsoplossing, vervang deze door antilichaamoplossing en incubeer.
   • gooi de antilichaamoplossing weg, was het membraan.
8. volg de aanwijzingen van de fabrikant voor chemiluminescentiedetectie.

Noordelijke vlek

Noordelijke vlekken worden gebruikt om de identiteit, grootte en abundantie van specifieke RNA-sequenties te bepalen. De noordelijke vlekprotocollen beginnen met de isolatie van RNA, en de scheidingstechnieken variëren afhankelijk van de grootte van RNA. Grote RNAs worden gescheiden door elektroforese op een formaldehyde – agarose-gel of glyoxal – agarose-gel, dat normale basisparing verhindert en RNA in een gedenatureerde staat handhaaft. Kleine RNAs worden gescheiden op een denaturerend (ureum) polyacrylamidegel. RNA wordt dan overgebracht van het gel aan een nylon membraan dat dan met een Radioactive of nonisotopically geëtiketteerd RNA, DNA, of oligodeoxynucleotide-sonde wordt uitgebroed. De ongehybride sonde wordt verwijderd door het wassen met buffer. Radiolabeled sondes worden gevisualiseerd met röntgenfilm, en enzymatisch geëtiketteerde sondes worden gevisualiseerd met chemiluminescentie.

Northern blot protocol

1. RNA-isolatie
2. elektroforese:
   • voor een formaldehyde-agarosegel: bereid de gel en steek de gelbak in het apparaat. Vul met MOPS-buffer, laad de monsters en voeg een molecuulgewicht-teller toe. Voer de gel uit en trim de gel vóór het bevlekken.
   • voor een glyoxal agarose-gel: bereid de gel en steek de gelbak in het apparaat. Vul met MOPSBUFFER, bereid monsters voor en laad in Putten samen met RNA-ladder.
   • voor een denaturerende polyacrylamidegel: giet de gel en monteer deze in de elektroforese-eenheid. Bereid monsters voor, laad ze in de gel en voer ze uit met TBE-loopbuffer.
3. Transfer:
   • voor een formaldehyde – agarosegel of glyoxal-agarosegel: was de gel in SSC en monteer de transfereenheid met de gel, filtreerpapier en nylon membraan. Wanneer de overdracht is voltooid, plaats het membraan in een UV cross-Link.
   • voor een denaturerende polyacrylamidegel: zet de transferunit samen met gel, filtreerpapier en nylon membraan om ervoor te zorgen dat ze worden overspoeld met TBE. Wanneer de overdracht volledig is, plaats het membraan in een UV cross-linker om RNA aan het membraan te bevestigen.
4. Pre-hybridisatie (blokkering):
   • pre-hybridisatie van het membraan in hybridisatie-oplossing.
5. hybridisatie:
   • voeg sonde toe aan de hybridisatieoplossing en incubeer.
   • was het membraan in wassingen met lage stringency om hybridisatieoplossing en niet-gehybridiseerde sonde te verwijderen, en was het membraan met hoge stringency om gedeeltelijk gehybridiseerde moleculen te verwijderen.
   • volg de aanwijzingen van de fabrikant voor chemiluminescentiedetectie.

Western Blot

Western blots worden gebruikt om de identiteit, grootte en abundantie van specifieke eiwitten in een monster te bepalen. Het westelijke vlekprotocol begint met de voorbereiding van de steekproeflysaat van weefsel of celcultuur en scheiding op een polyacrylamidegel via elektroforese. De gescheiden proteã nen worden dan overgebracht naar een nitrocellulose of polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan. Het membraan wordt geïncubeerd met een blokkerende agent om niet-specifieke band te verhinderen, door incubatie met een primair antilichaam wordt gevolgd om de proteã ne van belang te binden. Er zijn twee detectiemethoden, direct en indirect. De directe opsporing (Figuur 2) steunt op een geëtiketteerd primair antilichaam, terwijl de indirecte opsporing een primair antilichaam tegen het doelproteã ne vereist, en een secundair antilichaam tegen de immunoglobineklasse of subklasse van de species van het primaire antilichaam (Figuur 3). De visualisatiemethodes omvatten colorimetrische analyses waarin een gekleurd precipitaat, chemiluminescentie, en fluorescentie wordt geproduceerd.

Western blot protocol

1. bereid lysaat uit celcultuur of weefsel.
2. monstervoorbereiding:
   • Bepaal de eiwitconcentratie van elk monster met een eiwitkwantificatietest (d.w.z. Bradford assay).
   • voeg een gelijk volume van 2X laemmli monsterbuffer toe aan elk monster.
   • sommige monsters moeten mogelijk worden gereduceerd of gedenatureerd, dit wordt bereikt door monsters in buffer te koken.
3. elektroforese:
   • Maak een gel van de SDS-pagina, plaats monsters samen met de molecuulgewichtmarker.
   • Voer de gel uit in actieve buffer.
4. overdracht:
   • assembleer na elektroforese de overbrengeenheid met het gel -, PVDF-of nitrocellulosemembraan en filtreerpapier.
   • breng de eiwitten over naar het membraan met transferbuffer.
5. Antistofkleuring (indirecte detectie):
   • maak blokkeringsbuffer en incubeer het membraan om niet-specifieke binding te verminderen.incubeer het membraan met primair antilichaam verdund in blokkeringsbuffer.
   • was het membraan in TBST en incubeer met geconjugeerd secundair antilichaam verdund in blokkeringsbuffer.
   • was het membraan in TBST.
   • volg de aanwijzingen van de fabrikant voor chemiluminescentiedetectie.