informacja kliniczna
25-letni Chińczyk (IV-1) żonaty z nie spokrewnioną kobietą z normalnymi chromosomami (IV-2). Para miała syna (V-1), który zmarł w wieku 6 miesięcy bez autopsji. Wcześniejsze analizy chromosomów wykazały,że V-1 miał kariotyp 45,XY, der(14;15)(q10;q10). Rodzice propositusa (IV-1) są fenotypowo normalnymi kuzynami pierwszego stopnia (III-1, III -2). Ich rodzice, wspólny wujek i obaj dziadkowie nie byli dostępni do analizy cytogenetycznej (rys. 1). Badanie stanu psychicznego zostało przeprowadzone na IV-1 przez psychiatrę.
analiza kariotypu
fluorescencja in situ hybrydyzacja (Fish)
chromosomy plemników od pacjenta III-1 I IV-1 były analizowane przez FISH. Próbki nasienia oceniano pod względem objętości, stężenia i ruchliwości zgodnie z kryteriami Światowej Organizacji Zdrowia. Po analizie nasienia, stopniowo ruchome plemniki izolowano i dwukrotnie przemywano buforowanym fosforanem roztworem soli fizjologicznej (pH 7.4) i wirowane przy 1500 obr. / min przez 11 min. Granulki utrwalano w 5 ml mieszaniny kwas octowy/metanol (1: 3) przez co najmniej 30 minut w temperaturze 4 °C. iloczyny (40-50 µl) powstałej zawiesiny jąder rozmazywano na zimnych, wstępnie oczyszczonych szkiełkach. Dekondensację jąder przeprowadzono w 1 N NaOH przez 2 min. Szkiełka zostały następnie zdegradowane przez stopniowaną serię etanolu (70 %, 90 %, 100 %) i denaturowane 0,25% formamidem w 2xSSC, a następnie przez noc hybrydyzację z kombinacją dostępnych w handlu sond. W badaniu wykorzystano dwa zestawy mieszanin sond. Ryby dwukolorowe przeprowadzono przy użyciu sond locusspecific (LSP) i TEL z Vysis (Vysis, Downers Grove, IL, USA). Dla pacjentów IV-1 I III-1 zastosowano sondę TelVysion 14q(D14s1420, Spectrum Red) dla 14q32.33, A sondę TelVysion 15q (D15s120, Spectrum Green) dla 15q26.3.
aby zbadać obecność efektu interchromosomalnego, trójbarwną rybę przeprowadzono przy użyciu drugiej mieszaniny sond, która składa się z komercyjnych sond satelitarnych (DNA) z Vysis, w tym chromosomów 18, X I Y (CEP 18, Spectrum Blue/CEP X, Spectrum Green/CEP Y, Spectrum Red). Płukania po hybrydyzacji obejmowały 2 min w 0,4 xSSC/0,3% NP-40 (pH = 7) w temperaturze 72 °C, a następnie 1 min w 2xssc / 0,1% NP-40 (pH = 7) w temperaturze pokojowej. Szkiełka były pokryte DAPI II (Vysis). Oceniano tylko nienaruszone plemniki o podobnym stopniu dekondensacji i wyraźnych sygnałach hybrydyzacji. Wszystkie uszkodzone lub nakładające się plemniki zostały wyłączone z analizy. Analizowano preparaty o skuteczności hybrydyzacji 99 % i większej. Analizowano 1000 jąder plemników na pacjenta.
array comparative genomic hybridization (aCGH)
array comparative genomic hybridization (aCGH) został wprowadzony w diagnostyce klinicznej, aby szybko wykryć zyski i straty w całym genomie z wyższą rozdzielczością . Jest to metoda o wysokiej przepustowości, która wykrywa zmiany liczby kopii do rozdzielczości nawet 1 Kb. Do analizy aCGH DNA Pobrano z krwi obwodowej. analiza aCGH została przeprowadzona przy użyciu macierzy komercyjnych 8 × 60 K (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).
analiza danych
analiza statystyczna została przeprowadzona przy użyciu systemu SAS (2002-2003, SAS Institute Inc., Cary, NC). Test Chi-kwadrat został użyty do analizy segregacji mejotycznej. Wartość prawdopodobieństwa mniejsza niż 0,05 (P < 0,05) została uznana za statystycznie istotną.
wyniki
analiza kariotypu została przeprowadzona na czterech członkach rodziny i wykryto dwa różne kariotypy translokacji Robertsona. Wyniki przedstawiono poniżej. III – 1 I III-2 były heterozygotyczne, podczas gdy IV-1 był homozygotyczny.
-
III-1: 45,XY,der(14;15)(q10;q10)
-
III-2: 45,XX,der(14;15)(q10;q10)
-
IV-1: 44,XY,der(14;15)(q10;q10), der(14;15)(q10;q10)
-
IV-2: 46,XX
ponieważ pacjent (IV-1) ma objaw apatii, skierowaliśmy go do psychiatry na dokładne badanie stanu psychicznego. Pacjent nie miał historii psychiatrycznej i pozostawał współpracownikiem podczas przesłuchania psychiatrycznego. Jego procesy myślowe były liniowe, logiczne i konsekwentnie ukierunkowane na cel, a jego osąd był nienaruszony. Dlatego nie obserwowano objawów psychiatrycznych. Ponadto konsultacja neurologiczna nie wykazała ogniskowych deficytów neurologicznych. Wyniki tomografii czaszkowo-mózgowej (CT) i punkcji lędźwiowej (LP) były prawidłowe. Elektroencefalografia (EEG) nie wykazała żadnych oznak aktywności napadowej.
analiza aCGH na IV-1 wykryła duplikację 2,03 Mb w regionie q11.1-q11.2 na chromosomie 15 (Fig. 3). Według Copy number variation database (CNVdb) powielanie to jest polimorfizmem chromosomalnym w normalnej populacji. Ponieważ IV-1 jest homologicznym nośnikiem translokacji Robertsona, a jego dwa pochodne chromosomy pochodzą od tego samego nośnika translokacji Robertsona, spekulowaliśmy, że każdy z dwóch pochodnych chromosomów powinien mieć duplikację 2,03 Mb w regionie q11.1-q11.2 na chromosomie 15.
w celu analizy nasienia III-1 I IV-1, próbki nasienia z dwóch różnych Robertsonian translokacji nośników (III-1 I IV-1) oceniono pod kątem objętości, stężenia i ruchliwości zgodnie z kryteriami Światowej Organizacji Zdrowia. Objętość, stężenie i mobilność plemników w III-1 są znacznie zmniejszone ze względu na podeszły wiek. Natomiast wszystkie są normalne w IV-1 (Tabela 1). Następnie przeanalizowaliśmy mejotyczne wzorce segregacji w tych dwóch różnych transporterów translokacji Robertsona. W heterozygocie Robertsonian translokation carrier (III-1), częstość prawidłowych / zrównoważonych plemników wynikających z alternatywnej segregacji wynosiła 79,9 %, podczas gdy częstość niezbalansowanych plemników wynikających z sąsiedniej segregacji wynosiła 20,1%, co jest znacznie wyższe niż w populacji normalnej (Tabela 2). Natomiast w translokacji Homozygota Robertsona (IV-1) częstość występowania plemników zrównoważonych wynosiła 99,7%, podczas gdy częstość niezbalansowanych plemników wynosiła tylko 0,3 %, co jest podobne do normalnych populacji (Tabela 2). Dane te wykazały, że prawie wszystkie plemniki Robertsonian translokacji homozygoty były zrównoważone, podczas gdy te heterozygoty miał procent niezrównoważony. Ponadto analiza chromosomów plemników IV-1 wykazała kariotyp 22,X,der (14;15) lub kariotyp 22,Y,der(14;15) potwierdzający nasze spekulacje. Jak pokazano na Fig. 4, strzałka wskazała plemnik z czterema sygnałami fluorescencyjnymi (dwa czerwone i dwa zielone), co sugeruje, że plemnik ten ma dwa chromosomy pochodne der(14;15). Dane te sugerują potencjalny mechanizm specjacji u ludzi poprzez translokację Robertsona.