Expedition to South America
w Humboldcie urosło przekonanie, że jego prawdziwym celem w życiu była naukowa eksploracja, a w 1797 roku zrezygnował ze stanowiska, aby z wielką jednomyślnością zdobyć gruntowną wiedzę o systemach pomiarów geodezyjnych, meteorologicznych i geomagnetycznych. Wstrząsy polityczne wywołane wojnami napoleońskimi uniemożliwiły realizację kilku ekspedycji naukowych, w których Humboldt miał okazję uczestniczyć. W końcu, przygnębiony rozczarowaniami, ale nie chcąc zniechęcać się do swojego celu, uzyskał zgodę rządu hiszpańskiego na wizytę w hiszpańskich koloniach w Ameryce Środkowej i Południowej. Kolonie te były wówczas dostępne tylko dla hiszpańskich urzędników i misji Rzymskokatolickiej. Całkowicie odcięte od świata zewnętrznego, dawały ogromne możliwości badaczowi naukowemu. Pozycja społeczna Humboldta zapewniała mu dostęp do oficjalnych kręgów, a w hiszpańskim premierze Mariano de Urquijo znalazł oświeconego człowieka, który poparł jego wniosek do króla o pozwolenie Królewskie. Latem 1799 wypłynął z Marsylii w towarzystwie francuskiego botanika Aimé Bonplanda, którego poznał w Paryżu, wówczas najżywszym ośrodku naukowym w Europie. Majątek, który odziedziczył po śmierci matki, umożliwił Humboldtowi sfinansowanie wyprawy całkowicie z własnej kieszeni. Humboldt i Bonpland spędzili pięć lat, od 1799 do 1804, w Ameryce Środkowej i Południowej, pokonując ponad 6000 mil (9650 km) pieszo, konno i kajakami. Było to życie pełne wielkiego wysiłku fizycznego i poważnego niedostatku.
począwszy od Caracas, podróżowali na południe przez łąki i zarośla, aż dotarli do brzegów Apure, dopływu rzeki Orinoko. Kontynuowali swoją podróż po rzece kajakiem aż do Orinoko. Po jej biegu i biegu Casiquiare udowodnili, że rzeka Casiquiare tworzy połączenie pomiędzy rozległymi systemami rzek Amazonki i Orinoko. Przez trzy miesiące Humboldt i Bonpland przemieszczali się przez gęste lasy tropikalne, dręczone przez chmury komarów i tłumione przez wilgotny upał. Ich zapasy zostały wkrótce zniszczone przez owady i deszcz; brak pożywienia ostatecznie zmusił ich do przetrwania na zmielonej dzikiej fasoli kakaowej i wodzie rzecznej. Jednak obaj podróżnicy, pobudzeni ekscytacją dostarczaną przez nowe i przytłaczające wrażenia, pozostali zdrowi i w najlepszych duchach aż do powrotu do cywilizacji, kiedy ulegli silnej gorączce.
Po krótkim pobycie na Kubie Humboldt i Bonpland wrócili do Ameryki Południowej na rozległe eksploracje Andów. Od Bogoty do Trujillo w Peru wędrowali przez Wyżyny andyjskie—podążając trasą, którą obecnie przemierza Autostrada Panamerykańska, w swoim czasie ciągiem stromych, skalistych i często bardzo wąskich ścieżek. Wspięli się na kilka szczytów, w tym na wszystkie wulkany w okolicach Quito, Ekwador; wejście Humboldta na Chimborazo (20,702 stóp ) na wysokość 19,286 stóp (5,878 metrów), ale bez szczytu, pozostało światowym rekordem wspinaczki górskiej przez prawie 30 lat. Wszystkie te osiągnięcia zostały przeprowadzone bez pomocy nowoczesnego sprzętu alpinistycznego, bez lin, raków i zapasów tlenu, dlatego Humboldt i Bonpland ciężko cierpieli z powodu choroby górskiej. Ale Humboldt obrócił swój dyskomfort na korzyść: stał się pierwszą osobą, która przypisywała chorobę górską brakowi tlenu w rozrzedzonym powietrzu na dużych wysokościach. Badał również prąd oceaniczny u zachodnich wybrzeży Ameryki Południowej, który pierwotnie został nazwany jego imieniem, ale obecnie jest znany jako prąd Peru. Kiedy para przybyła, noszona i na nogach, w Quito, Humboldt, doświadczony alpinista i niestrudzony zbieracz danych naukowych, nie miał trudności z przejęciem roli dworzanina i człowieka świata, gdy został przyjęty przez wicekróla i przywódców hiszpańskiego społeczeństwa.
wiosną 1803 roku dwaj podróżnicy popłynęli z Guayaquil do Acapulco w Meksyku, gdzie spędzili ostatni rok swojej wyprawy w ścisłej analizie tej najbardziej rozwiniętej i wysoce cywilizowanej części hiszpańskich kolonii. Po krótkim pobycie w Stanach Zjednoczonych, gdzie Humboldt został przyjęty przez U. S. Pres. Thomas Jefferson popłynął do Francji.
Humboldt i Bonpland wrócili z ogromną ilością informacji. Oprócz ogromnej kolekcji nowych roślin, istniały oznaczenia długości i szerokości geograficznych, pomiary składników pola geomagnetycznego Ziemi, codzienne obserwacje temperatur i ciśnienia barometrycznego, a także dane statystyczne dotyczące warunków społecznych i ekonomicznych Meksyku. Ilekroć Humboldt znalazł się w Centrum Handlu w Ameryce, wysyłał raporty i duplikaty swoich zbiorów swojemu bratu Wilhelmowi, który stał się wybitnym filologiem, oraz francuskim naukowcom; niestety blokada kontynentalna wymuszona wówczas przez brytyjskie okręty uniemożliwiła dotarcie większej części jego poczty do miejsca przeznaczenia.