podobnie jak w przypadku izolacji DNA, naukowcy często polegają na zestawach do izolacji RNA, aby ułatwić im życie. Niedawno opublikowaliśmy blog na temat oczyszczania DNA bez zestawu, który przedstawił kilka powodów, dla których robienie czegoś bez zestawu ma zalety: mniej odpadów plastikowych, mniej wydatków i mniej bycia pozostawionym z kilkoma przypadkowymi rozwiązaniami, gdy wszystkie kolumny wirowania się skończą. W tym artykule omówimy podstawy izolowania RNA bez zestawu.

Wskazówki dotyczące pracy z RNA (niezależnie od tego, czy używasz zestawu, czy nie)

chociaż jest rzeczą oczywistą, że należy zachować ostrożność podczas wykonywania jakiegokolwiek rodzaju oczyszczania DNA lub RNA, aby uniknąć zanieczyszczenia, należy zachować szczególną ostrożność podczas wykonywania ekstrakcji RNA. RNA z natury nie jest tak stabilny jak DNA-jest jednoniciowy, a jego grupy rybozowe są podatne na hydrolizę i degradację cieplną. Ponadto RNazy lub enzymy, które degradują RNA, są szczególnie odpornymi białkami, które znajdują się we wszystkim, w tym na skórze. Oto kilka ogólnych wskazówek dotyczących pracy z RNA, nawet jeśli używasz zestawu:

• zawsze noś rękawiczki, ponieważ RNazy na dłoniach mogą degradować RNA.
• utrzymuj czysty obszar roboczy, który może obejmować opryskiwanie ławki produktem, aby pozbyć się RNases, takich jak RNaseZAP.
• podczas zbierania tkanek, komórek, roślin, grzybów lub bakterii, utrzymuj próbki w chłodzie i szybko pracuj, aby złagodzić degradację RNA.
• upewnij się, że używasz wody oczyszczonej DEPC lub wolnej od RNazy. W przypadku stosowania wody uzdatnionej metodą DEPC, należy autoklawować wodę w autoklawie, aby dezaktywować DEPC.
• upewnij się, że plastik lub szkło używane jest wolne od RNazy. Plastik wolny od RNazy jest łatwo dostępny od dostawców naukowych, a wyroby szklane powinny być traktowane roztworem DEPC przez 1 godzinę i sterylizowane w autoklawie w celu usunięcia pozostałości DEPC. Alternatywnie, szkło można piec w temperaturze 180°C przez co najmniej 4 godziny.
• jeśli ostatnia próbka (próbki) RNA jest zawieszona w wodzie lub buforze TE, przechowuj je w zamrażarce o temperaturze -80°C, aby zapobiec degradacji RNA. Ulegną degradacji w zamrażarce o temperaturze -20°C.

metody ekstrakcji RNA przekształciły się w prosty protokół nadal używany dzisiaj

istnieje wiele alternatywnych metod izolowania DNA bez zestawu. Jednak tak nie jest w przypadku ekstrakcji i oczyszczania RNA. Jest jedna prosta metoda, która działa, i wariacje do tej metody. Główną przeszkodą w opracowywaniu protokołów izolowania RNA było to, że RNazy są powszechnie spotykane w komórkach, a bez czegoś, co blokuje aktywność RNazy po lizie komórki, RNA ulega degradacji. Aby skutecznie wyizolować nienaruszony RNA, potrzebny byłby szybki, silny denaturant białka – coś, co rozkładało RNazy, zanim RNazy miały szansę rozkładać RNA po lizie komórek.

pod koniec lat siedemdziesiątych Chirgwin i współpracownicy wykazali, że zrobił to silny denaturant białka, tiocyjanian guanidyny (Chirgwin et al., 1979). Opracowali protokół przeznaczony do izolowania RNA ze śledziony szczura, w którym homogenizowali śledziony w roztworze tiocyjanianu guanidyny i obracali homogenizator w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału. Następnie homogeniat załadowano na gradienty chlorku cezu i ultracentryfikowano przez okres do 20 godzin w celu oddzielenia nienaruszonego RNA od DNA i białek. Chociaż jest bardzo skuteczny w izolowaniu całkowitego RNA, metoda ta wymaga dużo czasu i w zależności od liczby próbek, dostęp do jednego lub więcej dużych, drogich ultracentrifuge.

Rysunek 1: zarys różnych etapów ekstrakcji RNA.

naukowcy z NIH w połowie lat 80-tych postanowili opracować protokół, który całkowicie pominął ultracentryfugację. Chomczynski i Sacchi wykazali, że RNA można skutecznie oddzielić od DNA i białek za pomocą prostego protokołu ekstrakcji tiocyjanianem guanidyny-fenol-chloroformem. W tej metodzie próbki są nadal homogenizowane i lizowane w roztworze tiocyjanianu guanidyny. Jednak zamiast rozdzielania RNA przy użyciu gradientów cezu i chlorku, do homogeniatu dodaje się nasycony wodą fenol, octan sodu i chloroform i wstrząsa. Po szybkim odwirowaniu (nie ultracentryfugacji!), warstwy fenolu i chloroformu oddzielają się, a RNA jest zatrzymywane w górnej, wodnej warstwie, podczas gdy DNA i inne białka są zatrzymywane w międzyfazowej i dolnej, organicznej warstwie. Górna warstwa wodna jest ekstrahowana i RNA może być wytrącony izopropanol. Metoda ta skróciła czas potrzebny na wyizolowanie RNA z ponad 20 godzin do około 4 godzin, a wariacje na temat tej metody no-kit są nadal szeroko stosowane (Chomczynski i Sacchi, 2006).

Zobacz nasz protokół ekstrakcji RNA!

dzięki czemu prosty protokół jest jeszcze bardziej niezawodny(nadal bez zestawu!)

jak wspomniano powyżej, praca z RNA wymaga utrzymywania próbek w stanie zimnym aż do homogenizacji i lizy komórek. Może to być trudne w zależności od sytuacji laboratoryjnej lub metody pobierania tkanek, dlatego firmy biotechnologiczne wprowadziły na rynek kilka produktów, które pomagają jeszcze bardziej usprawnić ten proces i/lub ustabilizować RNA podczas pobierania i homogenizacji tkanek. Najbardziej znanym z tych produktów jest TRIzol® (zwany także TRI Reagent®, RNAZOL®, QIAzol® i sprzedawany przez wiele różnych firm). TRIzol® jest kompleksowym roztworem kwasu-guanidyny-fenolu, który łączy w jednym kroku roztwór homogenizacji i dodanie fenolu w oryginalnym protokole no-kit. Po homogenizacji w TRIzol® nierozpuszczalny materiał jest usuwany przez odwirowanie, a supernatant ekstrahuje się chloroformem, jak w powyższej metodzie no-kit.

naukowcy opracowali również sposoby „stabilizacji” RNA w tkankach przed Lizą komórek. Produkty te, a mianowicie RNAlater® firmy Thermo i Rnaprotect® firmy Qiagen, są roztworami na bazie siarczanu amonu, które działają poprzez hamowanie aktywności RNazy w komórkach lub tkankach – w rzeczywistości chemicznie nie stabilizują cząsteczek RNA (Allewell and Sarma, 1974). Dodatkowo, ThermoFisher zapewnia protokół jak zintegrować RNAlater® z użyciem trizol® i roztworów stabilizujących siarczan amonu mogą być wykonane w domu.

częstym problemem z metodami ekstrakcji RNA no-kit jest przeniesienie DNA, które może potencjalnie skomplikować wyniki dalszego zastosowania, takiego jak ilościowa PCR w celu oceny ekspresji genu. Istnieje kilka rzeczy, które naukowcy mogą zrobić, aby zwalczyć ten problem. Przede wszystkim należy pamiętać o ekstrakcji-jeśli potrzebujesz naprawdę czystego RNA, ważne jest, aby podczas ekstrakcji wziąć tylko warstwę wodną, aby uniknąć przeniesienia DNA z dolnej, organicznej warstwy. Inną sztuczką jest wytrącenie RNA za pomocą chlorku litu. Roztwory LiCl selektywnie wytrącają RNA, ale nie DNA i białka. Na koniec, użycie DNazy (istnieje kilka produktów enzymatycznych DNazy na rynku do wyboru) na wymieszanej próbce RNA pomoże upewnić się, że zanieczyszczenie DNA nie stanowi problemu.

Chirgwin JM, przybyła AE, MacDonald RJ, Rutter WJ (1979) Izolacja biologicznie aktywnego kwasu rybonukleinowego ze źródeł wzbogaconych w rybonukleazę. Biochemistry 18:5294-5299. https://doi.org/10.1021/bi00591a005

Chomczynski P, Sacchi N (2006) The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate–phenol–chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols 1:581–585. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.83