pięć wariantów Pax-6 i ich wzorce ekspresji w zarodkach kałamarnic i tkankach oka dorosłych
wykonaliśmy pojedynczy 3′-rasowy PCR dla genu Pygmy squid Pax-6 (oznaczonego jako IpPax-6) w celu zbadania wariantów splicingu i wielu loci Pax-6 w zarodkach i tkankach oka dorosłych
głowonogi coleoidalne. Odkryliśmy, że nie ma wielu loci w kałamarnicy pigmejskiej, ale zidentyfikowaliśmy trzy warianty Pax-6 o dyskretnych długościach. Różnice w sekwencjach aminokwasowych pomiędzy tymi wariantami Pax-6 ograniczono do ograniczonych regionów. Stąd hipoteza, że są one wynikiem alternatywnych zdarzeń splicingu pojedynczego locus. Następnie zweryfikowaliśmy obecność wariantów splicingu za pomocą RT-PCR i ostatecznie otrzymaliśmy pięć rodzajów wariantów splicingu, w tym pozorny ortolog autentycznego Pax-6 (ryc. Długość i struktura autentycznego IpPax-6 były podobne do genów Pax-6 występujących u innych gatunków kałamarnic, skorup euprymna i Loligo pealei15, 16. Authentic ippax-6 (authentic form, 499 aa) zawiera dwie niezależne domeny wiążące DNA, domeny PD i HD oraz domenę bogatą w C-terminal P/S/T (PST), która jest dedykowanym aktywatorem z partnerskim białkiem aktywującym Trans, jak pokazano u wielu zwierząt (Fig.1). Zarówno podobieństwo sekwencji białek, jak i drzewo filogenetyczne potwierdziły, że IpPax-6 był ortologiem muchówek ey i kręgowców Pax-4/6 (dodatkowa rycina 1). Cztery zidentyfikowane warianty wytwarzały białka o długości różniącej się od długości autentycznego IpPax-6 (Fig.1).
diagramy wariantów łączenia znalezionych w kałamarnicy pigmejskiej.
Górny rząd pokazuje szacunkową strukturę Egzon-intron genu squid Pax-6. Grot strzałkowy pokazuje intron potwierdzony w gatunkach kałamarnic w analizie genomowej PCR oraz w poprzednim badaniu. Forma autentyczna (499 aa) jest najliczniejsza i jest podobna do genu Pax-6 innych gatunków kałamarnic. Wariantom 1 i 3 brakuje eksonu 4-kodującego N-końcową połowę HD. Warianty 2 i 3 mają dodatkowy Egzon, Egzon 6, w domenie PST. Wariant 4 pokazuje również dodatkowy ekson 3 kodujący 20 aminokwasów w regionie łączącym między domenami PD i HD.
aby zbadać ekspresję specyficzną dla poszczególnych etapów ekspresji wariantów squid Pax-6, wykonaliśmy Q-PCR dla różnych tkanek i na różnych stadiach embrionalnych przy użyciu starterów zaprojektowanych do celowania w dodatkowe eksony IpPax-6 (rysunek 2& rysunek S2). Jaja kałamarnic wykazują gastrulację epiboliczną i bezpośredni rozwój bez typowych stadiów larwalnych mięczaka17. Oczy zarodkowe pojawiają się z zewnętrznego epidermu blastodisc i są różnicowane po etapie 18, z pigmentacją siatkówki począwszy od etapu 20. Soczewka pojawia się jako przezroczysta struktura przypominająca kij widoczna gołym okiem na etapie 25. Najpierw wykonaliśmy Q-PCR z użyciem starterów skierowanych na ekson 2, który obejmuje wszystkie pięć wariantów. Analiza Q-PCR wykazała, że IpPax-6 wyrażano na etapie 16 przed utworzeniem pęcherzyków oka (Fig. Intensywność ekspresji IpPax-6 była stopniowo regulowana wraz z rozwojem zarodka kałamarnicy (Fig. 2a), a gałka oczna wykazywała najwyższą intensywność ekspresji wśród badanych tkanek. Jak zaobserwowano u innych zwierząt bilaterian, autentyczne i wariantowe formy IpPax-6 były wyrażane w znacznie obniżonych poziomach w tkance mięśniowej. Następnie wykorzystaliśmy startery ukierunkowane na warianty pozbawione eksonu 4 (warianty 1 i 3, Fig. 2B). Startery wykryły warianty 1 i 3 na niskim poziomie w zarodkach w stadium 16 i w tkance gałki ocznej. Użyliśmy również starterów ukierunkowanych na warianty, w tym ekson 6 (warianty 2 i 3, Rysunek 2C). Analiza Q-PCR wykazała, że warianty 2 i 3 ulegały ekspresji w gałkach ocznych i płatach wzrokowych, a także w zarodkach w stadiach 16 i 25. Ponieważ tworzenie komórek fotoreceptorowych i soczewki rozpoczyna się w zarodkach na etapie 25, warianty, w tym ekson 6, mogą przyczyniać się do rozwoju oka. Wyniki pokazują, że wzorce ekspresji wariantów IpPax-6 znacznie różniły się od wzorców autentycznych IpPax-6.
wyrażenie wariantów Pygmy squid Pax-6.
poziomy ekspresji wszystkich wariantów IpPax-6 (A), wariantów bez eksonu 4 (warianty 1 i 3) (B) oraz wariantów zawierających ekson 6 (warianty 2 i 3) (C) oznaczono ilościowo za pomocą analizy RT-PCR w czasie rzeczywistym. Poziom ekspresji w każdej części ciała względem stopnia 16 (1.0) obliczono, a następnie znormalizowano do poziomu ekspresji Alfa-tubuliny. Kwantyfikacje przeprowadzono dwukrotnie na różnych cDNA generowanych niezależnie i obliczono średnie geometryczne. Oś y jest dowolna. Paski błędów reprezentują odchylenia standardowe. (D–G) analizy hybrydyzacji in situ z użyciem sond antysensownego RNA dla eksonu 2 ippax-6 (D, F) i eksonu 4 IpPax-6 (E, G). Sonda RNA zaprojektowana z eksonu 2 ukierunkowana na wszystkie pięć wariantów wykazała ekspresję Pax-6 w obszarze mózgu zarodków w stadium 22 (D) i w stadium 25 (F). Sonda RNA zaprojektowana z eksonu 2 wskazuje również na ekspresję Pax-6 wokół oczu (d’, widok z boku). Sonda RNA zaprojektowana z egzonu 4 ukierunkowana wewnętrznie na warianty, jak również z form wariantowych 2 i 4 wykazywała podobne wzorce ekspresji (E, G) jak sonda ukierunkowana na ekson 2, z wyjątkiem tkanki wokół oczu (E). Wynik ten sugeruje, że warianty z delecją eksonu 4 (warianty 1 i 3) wykazują specyficzną lokalizację w tkance wokół oczu w porównaniu z innymi wariantami (grot strzałki). Paski skali, 10 µm.
aby odróżnić, które warianty są obecne w każdym etapie, wykonaliśmy RT-PCR z wykorzystaniem zestawów starterów ponad granicami eksonu. Wariant 1 uznano za wyrażony we wszystkich / niektórych stadiach embrionalnych, ale nie w oczach dorosłych (dodatkowa rycina 2). Analiza RT-PCR wykazała również, że wariant 4 był silnie wyrażony w oczach dorosłych, szczególnie w siatkówce, ale nie w soczewkach (dodatkowa rycina 2A). Warianty 2 i 3 wyrażono we wszystkich stadiach embrionalnych, a także w tkankach dorosłych (rysunek uzupełniający 2b).
aby zidentyfikować specyficzną dla tkanek ekspresję wariantów IpPax-6, przeprowadziliśmy hybrydyzację in situ przy użyciu sond RNA zaprojektowanych do specyficznego wiązania się z każdym wariantem (Fig.2D-G). Sonda RNA zaprojektowana z eksonu 2 celuje we wszystkie pięć wariantów zidentyfikowanych w tym badaniu. Sonda RNA została zaprojektowana z eksonu 4 związanego z formą autentyczną oraz wariantami 2 i 4. Stwierdzono, że IpPax-6 jest zlokalizowany w obszarze mózgu, w tym w grzbietowym płacie podstawowym, górnym płacie czołowym, płatach szypułkowych/węchowych i płatach wzrokowych (Fig.18 tkanka poza siatkówką (być może odpowiadająca przyszłej warstwie irydoforu)również wyraźnie wyrażała IpPax-6 na etapie 22 (Fig. 2D i 2D’). Ekspresję IpPax-6 obserwowano w tej warstwie aż do etapu 25. Hybrydyzacja in situ z wykorzystaniem sondy ukierunkowanej na ekson 4 sugerowała, że warianty 2 i 4 mają podobne wzorce ekspresji w mózgu, ale nie w oczach (Fig.2e). To odkrycie sugeruje, że warianty 1 i 3 (bez eksonu 4) są regulowane w zewnętrznej warstwie oczu. Konsekwencje te oznaczają, że każdy wariant IpPax-6 jest regulowany niezależnie w procesach tworzenia oczu.
struktura Egzon-intronowa Pax-6 u innych głowonogów/mięczaków
badaliśmy, czy ten rodzaj alternatywnego splicingu został nabyty tylko u głowonogów coleoidalnych. Stosując analizę RT-PCR do zarodkowych RNA Japońskich kałamarnic włóczni (Loligo bleekeri), znaleźliśmy trzy typy mRNA prawdopodobnie pochodzące z alternatywnego splicingu (pomijanie eksonu 4, Wkładanie eksonu 3 i wkładanie eksonu 6) w oczach (ryc. 3A, B). Wstawione eksony 3 i 6 kodowały odpowiednio 20 i 40 aminokwasów, podczas gdy pominięty ekson 4 kodował 51 aminokwasów. Aby zbadać obecność podobnego alternatywnego splicingu w innych genomach mięczaków, zbadaliśmy struktury ekson-intron Pax-6 u Sowy limpet i ostrygi perłowej. Pełna sekwencja genomu sowy limpet (Lottia gigantea, otrzymana z portalu genomu JGI Lotgi v1.0, e_gw1.86.103.1)19 i ostrygi perłowej (Pinctada fucata, otrzymana z jednostki genomiki morskiej oist genome browser P. fucata_ver1.0, transkrypcja: pfu_aug1.0_8418.1_67856.T1, scaffold8418.1) 20 wykazało, że mięczak Pax-6 ma pięć eksonów. Exon 4 w kałamarnicy został zachowany na wszystkich badanych gatunkach mięczaków. Jednak eksony 3 i 5 nie zostały znalezione w genie pearl oyster Pax-6. W ten sposób odkryliśmy, że odmiany form 2 i 4 zostały nabyte w linii głowonogów coleoid (ryc. 1).
Indele Znalezione w wariantach IpPax-6 i przewidywanych strukturach 3D HD.
wyrównał sekwencje nukleotydów (a) eksonu 3 i (B) eksonu 6 kałamarnicy pigmejskiej i kałamarnicy włóczni japońskiej, odpowiednio. Wyrównanie translowanych sekwencji aminokwasowych HD stosowanych w modelowaniu porównawczym (C). Warianty 1 i 3 IpPax-6 nie mają części helisy 1. Trójwymiarowa struktura spliced HD uzyskana przez modelowanie homologiczne (D, D’). Zielone pałeczki wskazują białka IpPax-6, a szare kulki reprezentują docelowe cząsteczki DNA. Kropkowany okrąg wskazuje część helisy 1 utraconą przez usunięcie eksonu 4.
zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, nasze badanie jest pierwszym, w którym opisano warianty splicingu w ramce squid Pax-6, które zostały wyrażone w różny sposób w zależności od stadium embrionalnego. Wcześniejsze badania wyizolowały dyskretne typy wariantów splicingu, które utraciły N-końcową połowę domeny PD u innych gatunków squid15, 18, ale te warianty nie wykazały różnic przestrzenno-czasowych w ekspresji. Nasze badania sugerowały również, że mechanizmy leżące u podstaw akwizycji zmian transkryptów Pax-6 przez alternatywne splicing zostały wyjątkowo nabyte w linii głowonogów coleoidalnych, ponieważ niższe mięczaki, takie jak małże, nie posiadają odpowiedniego egzonopodobnego fragmentu w swoich genomach.
funkcja wariantów squid Pax-6 i ich przypuszczalna rola w rozwoju oka
oczekuje się, że dodanie i delecja fragmentu aminokwasu zakodowanego w alternatywnie stosowanych eksonach spowoduje zmiany strukturalne w wariantach białka IpPax-6, które mogą zmienić ich funkcję w procesie rozwoju. W dwóch jego wariantach (warianty 1 i 3) brakuje 153mer w środku autentycznego Pax-6 i połowy HD (ryc. 1). Aby zbadać, czy delecja wpływa na ich właściwości funkcjonalne, wykonaliśmy trójwymiarowe (3D) przewidywania strukturalne białek w oparciu o modelowanie porównawcze. Przypuszczalne struktury 3D HDS autentycznego IpPax-6 i wariantu pozbawionego segmentu kodowanego przez exon 3 zostały zbudowane. Struktura szablonu została zidentyfikowana przez formę związaną z DNA, dzięki czemu mogliśmy przewidzieć strukturę IpPax-6 i wariant w postaci związanej z DNA. Przypuszczalna struktura 3D autentycznej formy została w miarę dobrze modelowana; pozostałości rdzenia, a mianowicie Phe na pętli przed pierwszą helisą HD, Leu na pierwszej helisie, Leu na drugiej helisie oraz Trp i Phe na trzeciej helisie struktury modelowej, zostały zachowane, a trzy helisy HD były najwyraźniej szczelnie upakowane w siebie (Fig. 3C). Pozostałości ważne dla wiązania DNA, a mianowicie dwie pozostałości Arg NA N-końcowym ramieniu i pozostałości polarne na powierzchni trzeciej helisy, znajdowały się dość blisko interfejsu DNA (Fig. 3C, D). Jednak przypuszczalna struktura 3D wariantu przedstawiała szereg problematycznych kwestii. W modelowanej strukturze utrata regionu zakodowanego przez ekson 3, który koduje N-końcową część pierwszej helisy, została skompensowana przez 15 reszt zakodowanych w eksonie 2. Tak więc sekwencje aminokwasowe form autentycznych i wariantowych różniły się tylko w regionie zawierającym 15 reszt po N-końcowej stronie. Różnica ta jednak znacznie zwiększyła energię konstrukcyjną wariantu i najwyraźniej zdestabilizowała ogólną strukturę. Niestabilność ta może wynikać z braku Phe na pętli przed pierwszą helisą i Leu na pierwszej helisie. Składniki te są ewidentnie ważne dla pakowania trzech Helis. Ponadto w wariancie brakowało dwóch reszt Arg w pętli N-końcowej, które wiążą się z zasadami DNA w mniejszym rowku w formie autentycznej. Te problemy ze stabilnością i wiązaniem DNA w wariancie silnie sugerują, że HD wariantu jest niestabilne i że domena ma niewielkie powinowactwo wiązania do DNA (ryciny 3D i 3D’). Brak stabilnego HD sugeruje, że warianty 1 i 3 mają inne miejsca docelowe DNA niż autentyczny IpPax-6 u gatunków kałamarnic.
dwa warianty (warianty 2 i 3) również wykazywały wstawianie 120 mer w domenie PST (Rysunek 1). Wstawiona Sekwencja okazała się specyficzna dla kałamarnic (ryc. 2). To wstawienie może zmienić działania transaktywacji domeny PST. Wariant 4 wykazał unikalne wstawienie (57 mer) między PD i HD. Program Motif (http://www.genome.jp/tools/motif/) nie znalazł znanych domen ani podpisów w wstawionej sekwencji. Ta wstawka wydłuża łącznik między domenami PD i HD.