receptor androgenowy (AR) jest członkiem nadrodziny receptora jądrowego hormonu steroidowego, który obejmuje receptory estrogenowe, progestagenowe, glikokortykosteroidowe i mineralokortykoidowe.1 Wiązanie prototypowego, endogennie produkowanego testosteronu androgenowego (1) i ważnego aktywnego metabolitu dihydrotestosteronu (2) z AR inicjuje niezwykle zróżnicowany wachlarz aktywności biologicznych, które mogą się różnić w zależności od płci, wieku i stanu hormonalnego podmiotu. Aktywność AR ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego rozwoju i funkcji seksualnych człowieka, ale poza tą rolą, aktywacja AR ma również ważny wpływ na różne cele, takie jak kości, wątroba, mięśnie i ośrodkowy układ nerwowy.2,3 potencjał terapeutyczny sygnalizacji androgenowej jest dobrze doceniany w środowisku chemii medycznej i od dłuższego czasu chemicy poszukiwali związków, które selektywnie stymulują wzrost mięśni i kości, minimalizując proliferacyjny i/lub przerostowy wpływ na tkanki płciowe, takie jak prostata u mężczyzn i łechtaczka u kobiet.4,5 takie związki zostały nazwane selektywnymi modulatorami receptora androgenowego lub SARM. Pod tym względem prototypowy i endogenny androgen, testosteron, jest uważany za logiczny porównawczy. Związek 3 to GTX SARM S-22, a Związek 4 to BMS SARM 562929, z których oba opisano w literaturze jako doustnie aktywne związki o selektywności dla mięśni w stosunku do prostaty w stosunku do testosteronu w różnych modelach przedklinicznych.6,7

możliwość otrzymywania związków o aktywności selektywnej tkankowo, które różnią się od aktywności endogennego testosteronu odniesienia, może wynikać z faktu, że typowa aktywacja receptora AR, która jest inicjowana przez wiązanie cząsteczki z powinowactwem do AR do domeny wiążącej ligand AR, następuje następnie dość niezwykła, skoordynowana seria interakcji: Mogą one obejmować zmianę topologii receptora, dysocjację białek szoku cieplnego, dimeryzację receptora, fosforylację receptora, zdarzenia o szybkiej sygnalizacji, translokację do jądra (AR), skojarzenie z wieloma różnymi białkami koregulacyjnymi w celu utworzenia kompleksu transkrypcyjnego, który powoduje aktywację lub supresję syntezy RNA z genów modulowanych AR i wreszcie degradację receptora.8 ponieważ każda topologia kompleksu receptor-ligand jest unikalna dla tej struktury ligandu, można docenić, że interakcja konkretnego kompleksu ligand-receptor z białkami koregulacyjnymi może być również unikalna dla tego ligandu. Ponadto, ponieważ poziom ekspresji AR, konstelacja i poziom ekspresji białek koregulacyjnych oraz wzorce post-transkrypcyjnych zdarzeń regulacyjnych różnią się w każdym typie androgenowej komórki docelowej, a topografia miejsc regulacyjnych AR w genomie różni się w każdym Genie, ta niezwykła choreografia zdarzeń i interakcji zapewnia bogate środowisko, w którym można szukać SARM o pożądanym wzorze farmakologii selektywnej tkankowo, takiej jak wysoka anaboliczna, ale ograniczona aktywność androgenna.

dalsze komplikowanie naszego zrozumienia pochodzenia selektywności SARM jest „bio-amplifikacja” pierwotnego endogennego testosteronu androgenowego. Co ciekawe, endogennie produkowany i bardzo ważny testosteron androgenowy służy jako rodzaj „anty-SARM” lub „odwrotnego SARM”, ponieważ jego aktywność androgenna jest zwiększona przez konwersję do silniejszego 5α-dihydrotestosteronu przez enzym 5α-reduktazy w niektórych tkankach, w tym w skórze głowy i prostacie (ale nie w mięśniach ani kościach). W rezultacie androgeny, które nie są poddawane takiej bioamplifikacji w prostacie, wykazują lepszą selektywność w stosunku do mięśni w stosunku do prostaty w porównaniu z kontrolą poddaną testosteronu lub nienaruszonym zwierzęciem, którego podstawowym endogennym androgenem jest testosteron.9 mówiąc szerzej, można docenić, że różnice metaboliczne między endogennymi androgenami, takimi jak testosteron lub dihydrotestosteron i SARM, mogą również ręczyć za co najmniej pewne różnice selektywności.

nasza praca w obszarze SARM zaowocowała syntezą i oceną dużej liczby szablonów kandydatów. Chociaż stosunkowo łatwo było uzyskać związki o wysokim powinowactwie do AR, staraliśmy się uzyskać związki, które wykazywały dobrą skuteczność doustną i wysoką tolerancję in vivo. Po zeskanowaniu wielu potencjalnych tropów pod kątem doustnej aktywności in vivo osiągnęliśmy związek o wysokim powinowactwie 5 poprzez połączenie syntetycznych testów pośrednich, oceny literatury i kombinacji fragmentów. Byliśmy zachwyceni, gdy 5 wykazało aktywność doustną u szczurów.

jednak, gdy przeprowadziliśmy analizę farmakokinetyczną u szczurów, mogliśmy wykryć tylko bardzo niski poziom 5 po podaniu doustnym (F< 5%). Dalsza analiza wykazała, że 5 skutecznie przekształcano do 6in vivo, przypuszczalnie przez cytochromy P450 w wątrobie szczura.10 związek 6 wykazywał podobną aktywność do Związku 5in vivo, co sugeruje, że związek 6 był w dużej mierze odpowiedzialny za aktywność związku 5.11 badanie in vitro z ludzkimi mikrosomami wykazało szybki metabolizm związku 5, co wskazuje na tę transformację jako potencjalną odpowiedzialność metaboliczną człowieka i skłania nas do przygotowania związków, w których pozycja 4 ’ fenylu zawieszonego została zablokowana przed hydroksylacją indukowaną P450.12 przyjrzeliśmy się kilku analogom zawierającym grupę blokującą 4’i w trakcie naszych wysiłków zidentyfikowaliśmy związek 7 (RAD140; rysunek Figure1) 1) jako nasz przedkliniczny kandydat na rozwój.

syntezę związku 7 pokazano na schemacie 1.13,14 opieraliśmy się na szybkiej, ipso-fluorowej substytucji prekursora po lewej stronie, kawałek 8, d-treoniną w obecności K2CO3 w DMSO, aby uzyskać pożądany produkt 9 z wykonalną wydajnością (zazwyczaj>50%). Addukt d-Thr 9 był sprzężony z 4-cyjanobenzohydrazydem w standardowych warunkach sprzęgania przy użyciu EDCI i HOBt. Otrzymany produkt 10 sililowano za pomocą TBDMS-Cl, poddano odwodniającym Warunkom cyklizacji w obecności TPP / I2, a następnie odsilizowano w końcowym etapie.15-17 Ogólnie rzecz biorąc, okazało się to niezawodną i wydajną syntezą przy użyciu dość niedrogiego, choć nieproteinogennego aminokwasu jako źródła chiralności.

stabilność RAD140 była wysoka (T1/2> 2 h) W inkubacjach z mikrosomami szczura, małpy i człowieka, a także miała dobrą biodostępność u szczurów (F = 27-63%) i małp (65-75%). RAD140 wykazał doskonałe powinowactwo do receptora androgenowego (Ki = 7 nM vs 29 nM dla testosteronu i 10 nM dla DHT), a także dobrą selektywność w stosunku do innych receptorów jądrowych hormonu steroidowego, przy czym najbliższym receptorem docelowym jest receptor progesteronu (IC50 = 750 nM vs 0,2 nM dla progesteronu).Aktywność czynnościowego agonisty androgenów in vitro potwierdzono w teście różnicowania osteoblastów C2C12, gdzie wykazano EC50 0,1 nM (DHT = 0,05 nM).

RAD140 scharakteryzowano w wielu testach in vivo w celu określenia jego skuteczności doustnej w odniesieniu do szeregu parametrów związanych z aktywnością androgenną w modelach przedklinicznych. Na przykład RAD140 podawano zarówno młodym kastrowanym, jak i nienaruszonym samcom szczurów w celu oceny jego działania za pomocą szeregu endogennych androgennych źródeł sygnalizacji. Młody wykastrowany szczur zapewnia bardzo wrażliwy test in vivo na aktywność androgenną, ponieważ zwierzę jest stosunkowo naiwne wobec androgenów; zatem każda aktywność sygnalizacyjna z egzogennie podawanego androgenu nakłada się na zasadniczo puste tło.20 na fig. Rys. 2,2, Wpływ zwiększania dawek podawanego doustnie RAD140 (0 .5% metylocelulozy) na mięśniu bulbocavernosus („levator ani” lub „LABC”) i masie prostaty przedstawiono w stosunku do pojazdu (Kontrola wykastrowana), pozorowanej (Kontrola niekastrowana) i propionianu testosteronu (TP) podawanego podskórnie w dawce 1 mg/kg w oleju kukurydzianym.Jak widać, RAD140 stymuluje mięsień dźwigacza ani zaczynając od dawki 0,03 mg / kg (po) i osiąga poziom skuteczności równoważny do pozorowanego zwierzęcia operowanego w dawce 0,3 mg/kg.

ponieważ konsekwentnie obserwowaliśmy, że RAD140 nie osiągnął poziomu stymulacji gruczołu krokowego lub pęcherzyków nasiennych równego TP w dawce 1 mg / kg (bez względu na to, jak wysoka jest dawka RAD140), zdecydowaliśmy się sprawdzić, czy RAD140 może antagonizować wpływ TP na prostatę szczura i pęcherzyki nasienne, a jednocześnie określić, jaki wpływ może mieć jednoczesne podawanie RAD140 i TP na mięsień dźwigacza ani. Z wyników pokazanych na fig. Figure3, 3 wynika, że wysoka dawka RAD140 (10 mg/kg, po) faktycznie antagonizuje działanie TP przy 1 mg/kg na pęcherzyki nasienne, ale zwiększa wpływ TP na mięsień dźwigacza ani. Udało nam się ustalić, że skuteczna dawka dla osiągnięcia antagonizmu przez RAD140 wynosi 0,3−1 mg/kg (po) Dla 1 mg/kg TP (sc) (dane nie pokazano). W prostacie RAD140 również powodował tendencję spadkową w stymulacji przez TP, ale zmiana nie osiągnęła istotności statystycznej. Tak więc, w modelu młodego kastratowego samca szczura, RAD140 wydaje się być silnym i kompletnym agonistą androgenu na dźwigaczu ani, ale słabszym, częściowym antagonistą na pęcherzyku nasiennym i prawdopodobnie prostacie.22

celem większości przedklinicznych modeli in vivo jest najlepsze przewidywanie, jak lek będzie działał w populacji docelowej leku. Rozważając kwestię tego, jak stymulujący jest androgen na dowolnej tkance w modelu przedklinicznym, należy pamiętać, że poziom tła sygnalizacji androgenowej może wpływać na odpowiedź obserwowaną u zwierzęcia. Model wykastrowany szczura ma ograniczenia, ponieważ bardzo niski poziom endogennego androgenu w tym modelu jest sztuczną sytuacją, nie odzwierciedloną w docelowej dorosłej populacji mężczyzn.23 w szczególności docelowa populacja męska będzie miała podłoże androgenne znacznie powyżej kastratu, chociaż poziom androgenów będzie prawdopodobnie niższy niż norma dla ich grupy.

aby lepiej zrozumieć, jak ta grupa może reagować, zdecydowaliśmy się przyjrzeć młodym nienaruszonym samcom szczurów, ponieważ mają endogenny testosteron, ale na nieco obniżonym poziomie. Dlatego zachowują wrażliwość prostaty na związek androgenny, ale jednocześnie mają początkową stymulację, która jest bardziej podobna do populacji docelowej niż wykastrowane zwierzęta. Jak pokazano na fig.Figure4,4, RAD140 zwiększył masę mięśnia dźwigacza ani powyżej masy nienaruszonej grupy kontrolnej, zaczynając od najniższej badanej dawki (0,1 mg/kg). Co ciekawe, RAD140 nie wykazał stymulacji prostaty powyżej nienaruszonego poziomu kontroli zwierząt, aż do najwyższej badanej dawki, 30 mg / kg. W dawce 0, 3 mg/kg mc.RAD140 wykazywał skuteczność mięśni podobną do TP w dawce 0, 5 mg/kg mc., ale do osiągnięcia skuteczności prostaty w dawce 0, 5 mg/kg mc. konieczne było podanie dawki 30 mg/kg mc. RAD140.Z tego badania wynika, że u młodych nienaruszonych samców szczurów RAD140 wykazuje bardzo szeroki zakres selektywności w stosunku zarówno do szczurów leczonych TP, jak i szczurów z pozorowaną kontrolą.

wreszcie, byliśmy zainteresowani oceną wpływu RAD140 u młodych, męskich małp cynomolgous, aby ustalić skuteczne poziomy dawkowania w tym, co uznaliśmy za bardziej istotne przedkliniczne gatunki. Przeprowadziliśmy stosunkowo proste, nieterminalne badanie, które nadal pozwoliło nam ocenić anaboliczne, jak również lipidowe i inne kliniczne parametry chemiczne. Aby ocenić aktywność anaboliczną, najpierw przyjrzeliśmy się masie ciała brutto, o której wiedzieliśmy, że jest wrażliwym markerem anabolicznego działania androgenów u młodych, nieludzkich naczelnych. Wyniki 28-dniowego dawkowania RAD140 w dawce 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg i 1 mg/kg masy ciała zwierząt przedstawiono na fig.

ze względu na małą wielkość grupy (N = 3 dla każdej grupy dawkowania), wykorzystaliśmy zmianę masy tła każdego zwierzęcia na tygodnie przed eksperymentem, aby ustalić wartość początkową jako kontrolę. Ponieważ średnia masa ciała dla każdej grupy trzech małp zbiegła się do prawie identycznej liczby (dzień -1), przy bezwzględnym zakresie masy ciała pomiędzy grupami wynoszącym zaledwie 4,26−4,29 kg, na rysunku 5.5 narysowaliśmy absolutną masę ciała. W tym badaniu średni przyrost masy ciała o ponad 10% w ciągu zaledwie 28 dni od podania dawki osiągnięto po dawce zaledwie 0,1 mg/kg mc., z podobnym działaniem obserwowanym w grupie otrzymującej dawkę 1,0 mg/kg mc.

w celu określenia wpływu RAD140 na beztłuszczową tkankę i tkankę tłuszczową wykonano skany rentgenowskie („DEXA”) wszystkich małp na dwa dni przed rozpoczęciem podawania i jeden dzień po podaniu ostatniej dawki (dzień -2 i dzień 29); Wyniki przedstawiono na fig.6.6. Jak widać, nie było spójnego wpływu na absolutną masę tłuszczu, podczas gdy mięśnie wykazywały tendencję jakościową, która wzrasta wraz z dawką. Chociaż wydaje się, że większość przyrostu masy pokazanego na rysunku Figure55 była spowodowana wzrostem masy beztłuszczowej, żaden ze wzrostów masy tkanki nie był statystycznie istotny (p > 0,05), co może być spowodowane małymi rozmiarami grupy (n = 3) i stosunkowo dużymi odchyleniami standardowymi.27

Chemia kliniczna wykazała oczekiwane obniżenie stężenia lipidów (LDL, HDL, trójglicerydów).Pomimo dość drastycznego wzrostu masy ciała w tak krótkim czasie, nie stwierdzono u żadnego zwierzęcia zwiększenia aktywności aminotransferaz wątrobowych w żadnej dawce >dwukrotności wartości wyjściowej.29,30 biorąc pod uwagę dobrze ugruntowaną zależność między doustnym stosowaniem androgenów a wskaźnikami stresu wątrobowego, byliśmy bardzo zadowoleni, że w dawce 10-krotnie większej niż w pełni skuteczna dawka widzieliśmy Minimalne zwiększenie aktywności enzymów wątrobowych.31W sumie RAD140 ma Wszystkie cechy SARM. Jest selektywny, ponieważ stymuluje wzrost masy mięśniowej przy niższej dawce niż wymagana do stymulowania wzrostu masy prostaty. Co więcej, jest również selektywny pod względem skuteczności, ponieważ jest w pełni anaboliczny na mięśniach, ale wykazuje mniejszą niż całkowita skuteczność na prostacie i pęcherzykach nasiennych, a w rzeczywistości może częściowo antagonizować stymulację pęcherzyków nasiennych indukowanych testosteronem. RAD140 ma doskonałą farmakokinetykę i jest silnym anabolikiem również u ssaków naczelnych. Uważamy, że ogólny profil przedkliniczny RAD140 jest bardzo dobry, a związek zakończył przedkliniczną toksykologię zarówno u szczurów, jak i małp. Obecnie przygotowujemy RAD140 do badań klinicznych fazy I u pacjentów cierpiących na ciężką utratę wagi z powodu wyniszczenia nowotworowego.