hnscc z dodatnim i ujemnym wynikiem HPV/P16 wykazują różnice w zajętości węzłów
określiliśmy status HPV i P16 u 241 pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym jamy ustnej i gardła (OPC) leczonych radioterapią (C)chemią. Próbki ludzkiego guza pobrano zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Radę etyczną szpitali uniwersyteckich Leuven (Leuven, Belgia) i uzyskano domniemaną zgodę wszystkich pacjentów. Dane clinicopatologiczne uzyskano z Wykresów pacjentów, a średni czas obserwacji wynosił 4,19 roku. Pacjenci z dodatnim wynikiem HPV charakteryzowali się niższymi stopniami T, z 45% (26 z 58; p = 0,025) pacjentów z dodatnim wynikiem HPV wykazujących guzy w stopniu T1/2, podczas gdy 29% (51 ze 175; p = 0,025) w grupie z ujemnym wynikiem HPV. Ponadto guzy dodatnie HPV wykazywały znamiennie wyższe wartości (p = 0.014) udział węzłów z 72% (42 z 58) pacjentów z dodatnim wynikiem HPV wykazujących guzy N2/N3, podczas gdy tylko 54% (95 ze 175) w grupie z ujemnym wynikiem HPV. Chociaż związek między stanem p16 a stopniem N nie był znaczący, zaobserwowano tendencję do większego zaangażowania węzłowego i dodatniego stanu p16. U 63% pacjentów z dodatnim wynikiem p16 stwierdzono guzy N2/N3, natomiast w grupie z ujemnym wynikiem P16 tylko 54% (Tabela 1). Wyniki te są zgodne z innymi badaniami, pokazującymi, że pacjenci z HPV dodatnim HNSCC mają wyższe stadia N i niższe T.
zgodnie z przewidywaniami, niski poziom t powodował lepsze wskaźniki kontroli odległej (DC) przy 5-letnich wskaźnikach kontroli wynoszących 83% i 70% (p = 0, 04) dla pacjentów z guzy T1/T2 i T3 / 4 odpowiednio (dodatkowy plik 1: rysunek S1A). Guzy N2/3 (5-letnie DC 70%; P = 0,02) wykazały większe ryzyko odległej niewydolności w porównaniu z guzami N0/1 (5-letnie DC rate 85%; P = 0,02) (dodatkowy plik 1: Rysunek S1B). Nie zaobserwowano statystycznie istotnej różnicy w częstości występowania DC pomiędzy chorobą z dodatnim i ujemnym wynikiem HPV (wskaźnik DC wynoszący odpowiednio 5 lat 82% i wskaźnik DC wynoszący 5 lat 72%; p = 0,20) (dodatkowy plik 1: Rysunek S1C). Chociaż nie jest to istotne, ta 10% różnica w częstości występowania DC sugeruje wpływ wirusa poza lokalną kontrolą nowotworu. Ponadto wskazuje na obecność różnych schematów rozpowszechniania między HNSCC dodatnim i ujemnym HPV.
p16 tłumi inwazję i zdolność migracji hnscc z dodatnim HPV
aby zbadać mechanizm molekularny stojący za tymi potencjalnymi różnicami obserwowanymi w przerzutach w naszej kohorcie pacjentów, oceniliśmy zdolność migracji i inwazji komórek HNSCC in vitro. HPV / P16 dodatnie komórki SCC154 i SCC104 wykazały znacznie niższy wskaźnik migracji w porównaniu do HPV/P16 ujemne komórki SQD9, CAL27 i SC263 (Fig . 1a). Zgodnie z testem migracji, komórki HPV / P16 dodatnie wykazywały zmniejszone zdolności inwazyjne w porównaniu z komórkami HPV/P16 ujemnymi (Fig . 1B).
p16 represses the in vitro invasion and migration capacity of HPV positive HNSCC. a Migration capacity of HPV negative cells (SQD9, CAL27 and SC263) and HPV positive cells (SCC154, SCC104). b Invasion capacity of HPV negative SQD9 cells and HPV positive SCC154 cells. c Migration capacity of HPV positive SCC154 cells treated with shRNA for p16 (shp16) and control (shluc). D zdolność inwazyjna komórek SCC154 z dodatnim HPV leczonych shRNA dla p16 (shp16) i kontrolnych (shluc). (a-d) wynik jest pokazany jako średnia ± sem z trzech eksperymentów, a wartości p są obliczane przez dwustronny test t
supresor guza p16 jest dobrze znanym regulatorem cyklu komórkowego i dobrym markerem zastępczym dla HPV dodatniego HNSCC . Co więcej, Najnowsze dane przypisują szerszą rolę p16, w tym rolę w migracji i zahamowaniu angiogenezy . W związku z tym zbadano również wpływ p16 na zdolność migracji i inwazji komórek SCC154 z dodatnim HPV manipulowanych krótkim Spin RNA (shRNA) dla p16 (shp16) i kontrolnego shRNA (shluc). Zmniejszona regulacja ekspresji p16 zwiększyła zdolność migracji i inwazji komórek SCC154 (Fig. 1c i d). Dane te weryfikują obecność różnic we wzorcach rozpowszechniania między HNSCC dodatnim i ujemnym HPV i sugerują aktywną rolę p16 w kaskadzie przerzutowej.
p16 hamuje migrację i inwazję poprzez angiogenezę w HPV dodatnim HNSCC
wiadomo, że angiogeneza, która jest aktywnie podtrzymywana w komórkach nowotworowych przez czynniki proangiogenne, takie jak naczyniowy czynnik wzrostu śródbłonka a (VEGFA), jest kanałem rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych i przerzutów oraz promuje agresywną progresję nowotworu . Ponadto ujemna korelacja między HPV / p16 i VEGFA została wcześniej opisana w hnscc . Dlatego oceniliśmy zależność między HPV, p16 i VEGFA w naszej kohorcie pacjentów. Pacjenci z dodatnim wynikiem HPV wykazywali znamiennie niższą ekspresję VEGFA-54% (28 z 51) pacjentów nie wykazywało lub nie wykazywało niskiej ekspresji VEGFA w porównaniu do 32% (53 ze 161) w grupie z ujemnym wynikiem HPV (Tabela 2). Chociaż ujemna korelacja pomiędzy VEGFA i p16 była mniej wyraźna, zaobserwowano tendencję do istotności (Tabela 2).
shp16 lub shluc. W guzach myszy o niskiej ekspresji p16 wykryto większą liczbę naczyń krwionośnych w porównaniu z guzami kontrolnymi (Fig. 2A). Ponadto wzrost unaczynienia skutkował niższą martwicą, większą liczbą komórek mitotycznych i przewagą wzrostu guzów z ekspresją shp16 (dodatkowy plik 2: Rysunek S2A-C). Nie mogliśmy zweryfikować udziału p16 w tłumieniu przerzutów in vivo z powodu braku modelu zwierzęcego z przerzutami. Jednak przewaga wzrostu i zwiększone unaczynienie obserwowane w guzach myszy shp16 mogą wyjaśniać częste występowanie zaawansowanych stadiów T u pacjentów z hnscc bez HPV.
podwójna rola p16 w upowszechnianiu HNSCC. tworzenie naczyń krwionośnych w modelach scc154 shp16 i SCC154 shluc xenograft mysi ocenianych przez barwienie CD31 (powyżej wykresu); n = 5. B średnia liczba tworzenia naczyń limfatycznych w modelach myszy ksenogenicznych scc154 shp16 i SCC154 shluc oceniana przez barwienie live – 1 (powyżej wykresu); n = 5. C średni wynik barwienia integryny alpha4 beta1 w modelach scc154 shp16 i SCC154 shluc myszy xenograft; N = 5. d Average score of alpha4 beta1 integrin staining in HPV positive SCC154 (n = 7) and HPV negative SQD9 (n = 10) mouse xenograft models. wartości P a-d są obliczane przez dwustronny test t
P16 stymuluje limfangiogenezę i rozprzestrzenianie się węzłów u pacjentów z hnscc z dodatnim wynikiem HPV
wyniki te nadal nie wyjaśniają występowania podobnych odległych częstości nawrotów u pacjentów z hnscc z dodatnim i ujemnym wynikiem HPV/p16 i z pewnością nie wyjaśniają wysoce istotnego związku między pozytywnym wpływem wirusa HPV a zaangażowaniem węzłowym opisanym w naszym i kilku innych badaniach . Jest to szczególnie ważne, ponieważ implikuje obecność wysokiego lokalnego potencjału przerzutowego w HPV dodatnim HNSCC. Co ciekawe, limfangiogeneza, podobnie jak angiogeneza, Promuje przerzuty nowotworowe, indukując wzrost nowych naczyń limfatycznych w obrębie guza i zwiększając transport komórek do węzłów chłonnych. Ponadto zwiększona gęstość naczyń limfatycznych w guzach wiąże się ze zwiększeniem przerzutów do węzłów chłonnych. . W związku z tym oceniliśmy tworzenie naczyń limfatycznych za pomocą immunologii homologicznej naczyń limfatycznych hialuronan (LYVE-1) w guzach myszy shluc i shp16. Odkryliśmy, że supresja p16 powodowała zmniejszenie gęstości naczyń limfatycznych w przeszczepach HPV/P16 z dodatnim wynikiem sugerującym podwójną rolę p16 w przerzutach (Fig. 2b).
aby zrozumieć funkcję p16, skupiliśmy się na integrynach, ponieważ białka te są akceptowane jako kluczowe regulatory angiogenezy i limfangiogenezy . Ponadto wcześniej udokumentowano Wiązanie p16 z integrynami i utratę rozprzestrzeniania się komórek . Integryny takie jak alpha4 beta1 są ważnymi modulatorami limfangiogenezy . Dlatego oceniliśmy obecność integryny alfa4 beta1 w guzach myszy SCC154 shluc i SCC154 shp16. Although not statistically significant (p = 0.09), shluc tumors showed a higher percentage of integrin compared to shp16 tumors (Fig. 2c). In line with SCC154 shRNA xenografts, tumors from HPV/p16 positive SCC154 xenografts showed higher percentage of alpha4 beta 1 integrin compared to tumors from HPV/p16 negative SQD9 xenografts (Fig. 2d).