śródbłonek
śródbłonek rogówki stanowi najbardziej wewnętrzną warstwę rogówki, oddzielając ją od cieczy wodnistej w przedniej komorze oka (rys. 61.1). Śródbłonek składa się z pojedynczej warstwy (około 4 µm) płaskonabłonkowych komórek nabłonkowych, które charakteryzują się wyraźną ekspresją pomp jonowych, takich jak Na+/K+/ATPase i białka szczelnego połączenia, takiego jak ZO-1 (Tabela 61.1). Warstwa ta służy jako bariera do utrzymania prawidłowego stanu odwodnienia rogówki poprzez mechanizm wycieku pompy .
utrata lub dysfunkcja komórek śródbłonka rogówki (CECs) powoduje nadmierne gromadzenie się płynu w rogówce, powodując postępujący obrzęk, dezorganizację zrębu, zmniejszoną przezroczystość i zaburzenia widzenia . Głównymi przyczynami utraty śródbłonka rogówki i dysfunkcji są dystrofia śródbłonka, uraz / chirurgia lub przewlekłe zapalenie przedniej błony naczyniowej oka. Dystrofia śródbłonka rogówki Fuchsa i wrodzona dziedziczna dystrofia śródbłonka należą do najczęstszych dystrofii śródbłonka rogówki spowodowanych mutacjami genetycznymi i potencjalnymi czynnikami środowiskowymi . Inną częstą przyczyną dystrofii śródbłonka, rzekomej pęcherzowej keratopatii, jest wywołany przez uszkodzenie śródbłonka podczas operacji zaćmy. Cukrzyca i starzenie się są również istotnymi czynnikami ryzyka utraty śródbłonka rogówki.
w przeciwieństwie do komórek nabłonkowych, które mogą naprawiać się przez proliferację, dorosłe CECs mają ograniczoną zdolność proliferacyjną. Zamiast tego komórki śródbłonka mają tendencję do naprawy, przesuwając się w kierunku obszaru urazu i powiększenia sąsiednich komórek. Chociaż mechanizm ten utrzymuje barierę śródbłonka rogówki po urazie, zmniejsza również gęstość komórek śródbłonka i zmienia ich sześciokątną morfologię i zdolność pompowania. Gdy zmniejszenie gęstości komórek osiągnie zakres 500-1000 komórek/mm2 lub mniej, jedyną dostępną opcją terapeutyczną jest częściowe lub całkowite przeszczepienie rogówki . Obecnie przeszczep rogówki w przypadku utraty śródbłonka stanowi 60% wszystkich przeszczepów rogówki wykonanych w Stanach Zjednoczonych .
aby przezwyciężyć opisane powyżej niedobory dawców tkanek rogówki, początkowe wysiłki koncentrowały się na izolacji i ekspansji ex vivo pierwotnych CECs. Pierwsza udana kultura ludzkich CECs została zgłoszona w 1965 roku . Od tego czasu opracowano kilka modyfikacji w technikach izolacji, substratach macierzy zewnątrzkomórkowej i pożywkach hodowlanych, aby przezwyciężyć ograniczoną zdolność rozmnażania się komórek i utratę fenotypu CEC w hodowli . Na przykład Okumura et al. zbadano ekspresję różnych izoform lamininy w rogówce i zidentyfikowano lamininy-511 i 521 jako dominujące formy lamininy u dorosłych DM . Wykorzystując te dwie lamininy jako substrat do hodowli in vitro ludzkich CECs, udało im się znacznie poprawić przywiązanie, przetrwanie i ekspansję CECs . Inne grupy próbowały hodować Ludzkie CEC na ludzkich DMs pochodzących od dawców jako substraty. Zaletą tego podejścia jest to, że naśladuje środowisko rogówki in vivo w celu osiągnięcia prawidłowego utrzymania i wzrostu CEC . Znaczenie DM we wspieraniu ekspansji CEC zostało również potwierdzone w niedawnym badaniu przeprowadzonym w modelu uszkodzenia śródbłonka rogówki królika. Dzięki temu wykazano, że brak DM upośledza natywną migrację CEC i regenerację rogówki .
pomimo zalet, zastosowanie rusztowań komplikuje dostarczanie do rogówki, co wymaga skomplikowanych zabiegów chirurgicznych. Znacznie prostszym podejściem byłoby dostarczanie CECs w zawieszeniu komórek. Wstrzyknięcie komórek w zawiesinę pozwoliłoby na prostsze metody wytwarzania i teoretycznie byłoby mniej inwazyjne . Jednak takie podejście zwiększa ryzyko usunięcia wstrzykniętych komórek przez przepływ cieczy wodnistej, ograniczając przeżywalność komórek i wszczepienie w rogówce. Dwie metody opracowane w celu poprawy dostarczania zawiesin komórkowych do śródbłonka rogówki obejmują zastosowanie dostarczania kierowanego polem magnetycznym i coinjection komórek z inhibitorem skały. W przypadku dostarczania komórek magnetycznych CECs są znakowane cząstkami magnetycznymi i dostarczane do odpowiedniego miejsca na tylnej powierzchni rogówki za pomocą zewnętrznego magnesu . W niedawnym przykładzie CECs znakowano nanocząstkami superparamagnetycznymi i wstrzykiwano do przedniej komory oka dorosłych królików z urazem CEC. Podobnie jak natywny CEC, wstrzyknięte komórki utworzyły monowarstwę i przywróciły przezroczystość rogówki bez żadnych negatywnych skutków . Alternatywnie, Okumura et al. używane coinjection CECs z inhibitorem skały Y27632 w celu zwiększenia przeżywalności CEC i proliferacji. Takie podejście zaowocowało lepszym wszczepieniem komórek i lepszym odzyskiwaniem przezroczystości rogówki w króliczym modelu uszkodzenia rogówki . Te zbawienne efekty potwierdzono w małpim modelu dystrofii śródbłonka rogówki, co doprowadziło do rozpoczęcia badań klinicznych u ludzi. W 2018 r .ta sama grupa zgłosiła wyniki przeszczepu CECs, w połączeniu z inhibitorem skały, u 11 pacjentów z keratopatią pęcherzową; ponad 80% leczonych pacjentów wykazało odzyskanie grubości rogówki i poprawę ostrości wzroku 24 tygodnie po leczeniu. Badanie to dostarczyło pierwszych dowodów klinicznych, że małoinwazyjne przeszczepienie kultywowanych ludzkich CECs może być wykorzystane jako nowa opcja terapeutyczna w leczeniu dysfunkcji śródbłonka rogówki. Jednocześnie postawiono pytania dotyczące przyszłego rozwoju tego podejścia. Należą do nich konieczność określenia odpowiedniego przedziału wiekowego dawców do produkcji wysokiej jakości Przeszczepialnych CEC, mechanistyczny wkład inhibitora skał w wyniki kliniczne, precyzyjne dozowanie komórek w celu zrównoważenia skuteczności i bezpieczeństwa oraz opracowanie sposobu śledzenia losów dostarczonych komórek po przeszczepieniu . Ponadto ograniczona dostępność wysokiej jakości CEC dawców i ograniczona zdolność komórek do rozszerzania się in vitro wstrzymują pewne istotne wyzwania dla klinicznego tłumaczenia tego podejścia.
z tego powodu kilka grup próbowało wygenerować komórki podobne do CEC z alternatywnych źródeł komórek macierzystych, takich jak MSCs, komórki skórne, komórki zrębu rogówki i PSCs . Badania te zastosowały nasze obecne zrozumienie rozwoju embrionalnego CECs poprzez izolowanie przypuszczalnych populacji progenitorowych CEC, takich jak NCC, od komórek pierwotnych i różnicowanie ich do bardziej dojrzałych komórek CEC-podobnych. Na przykład, komórki zrębu rogówki i prekursory skórne zawierające NCC wyizolowano i hodowano w obecności kwasu retinowego i inhibitora GSK 3β (aktywatora szlaku sygnałowego Wnt) w celu indukcji komórek CEC-podobnych. Komórki te wykazywały regulację Pitx2, kluczowego czynnika transkrypcyjnego dla rozwoju przedniego odcinka oka, jak również regulację markerów CEC Atp1a1 i Cdh2. Co ważne, komórki wykazywały cechy funkcjonalne CECs, takie jak funkcja pompy. Kiedy komórki zostały przeszczepione przy użyciu arkusza kolagenowego jako nośnika, przywróciły widzenie w króliczym modelu keratopatii . Stosując podobne podejście, Shen et al. zróżnicowane prekursory pochodzenia skórnego poprzez współwystępowanie z b4g12, uwiecznioną ludzką linią CEC. W ciągu 1 tygodnia od różnicowania komórki wykazywały wyraźną ekspresję typowych markerów CEC. Przeszczepienie tych komórek spowodowało skuteczne odzyskanie grubości rogówki i przezroczystości rogówki w modelach dystrofii śródbłonka rogówki zarówno u królików, jak i u małp .
NCC mogą być również generowane in vitro z PSCs, oferując nieograniczone i rozszerzalne źródło komórek do zastosowań klinicznych. Zhang et al. opisywał różnicowanie ludzkich ESC do okularowych mezenchymalnych komórek prekursorowych (POMPs), podtypu NCC, przez kokulturę transwella z ludzkimi komórkami zrębu rogówki. Te indukowane pompki hodowano w uwarunkowanych mediach z komórek nabłonka soczewki, a różnicowanie potwierdzono przez testowanie ekspresji genu typowych markerów CEC, takich jak N-Cadherin, FoxC1 i PITX2. Aby wzbogacić komórki podobne do CEC, komórki posortowano i wysiewano na pozbawionej komórek matrycy rogówki świń, a następnie przeprowadzono udaną transplantację i indukcję naprawy rogówki w króliczy model dystrofii rogówki .
aby uniknąć stosowania materiału ksenogenicznego z dekellularyzowanej rogówki, najnowsze podejścia wykorzystują związki drobnocząsteczkowe i wolne od kseno czynniki wzrostu do indukowania losów komórek CEC. Na przykład kilka grup wykazało różnicowanie PSCs do NCC po hamowaniu szlaku tgfß / SMAD . Te NCC następnie hodowano w mediach zawierających PDGF-BB i Dkk2, które indukowały komórki do uzyskania sześciokątnego wyglądu i ekspresji markerów molekularnych komórek CEC . Co ważne, komórki mogą odkładać kolagen generując generowany in vitro DM i wyrażając główne składniki funkcji pompy śródbłonka rogówki, takie jak Na + K+ATPasea1. Chociaż obiecujący, funkcjonalny aspekt tych komórek CEC-podobnych do PSC oczekuje dalszych badań. Niektóre krytyczne pytania w przyszłości obejmują zdolność tych komórek CEC-podobnych do PSC do funkcjonowania jako nieszczelna bariera i utrzymania stanu odwodnienia rogówki,jak również badanie ich potencjału terapeutycznego in vivo.